Injerto de plántulas escalable, flexible y rentable

Resumen

Este protocolo describe un método robusto de injerto de plántulas que no requiere experiencia previa o capacitación y puede ejecutarse a un costo muy bajo utilizando materiales fácilmente accesibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular.

Resumen

El injerto de plántulas en etapa temprana se ha convertido en una herramienta popular en genética molecular para estudiar las relaciones raíz-brote dentro de las plantas. El injerto de plántulas en etapa temprana de la pequeña planta modelo, Arabidopsis thaliana, es técnicamente desafiante y requiere mucho tiempo debido al tamaño y la fragilidad de sus plántulas. Una creciente colección de métodos publicados describe esta técnica con diferentes tasas de éxito, dificultad y costos asociados. Este documento describe un procedimiento simple para hacer un dispositivo de injerto reutilizable interno utilizando mezcla de elastómero de silicona, y cómo usar este dispositivo para el injerto de plántulas. En el momento de esta publicación, cada dispositivo de injerto reutilizable cuesta solo $ 0.47 en materiales consumibles para producir. Usando este método, los principiantes pueden tener sus primeras plántulas injertadas con éxito en menos de 3 semanas de principio a fin. Este procedimiento altamente accesible permitirá a los laboratorios de genética molecular de plantas establecer el injerto de plántulas como una parte normal de su proceso experimental. Debido al control total que los usuarios tienen en la creación y diseño de estos dispositivos de injerto, esta técnica podría ajustarse fácilmente para su uso en plantas más grandes, como el tomate o el tabaco, si se desea.

Introducción

El injerto es una antigua técnica hortícola que se convirtió en una práctica agrícola establecida por 500 BCE¹. El injerto de diferentes variedades de plantas de cultivo para mejorar los rendimientos fue el primer uso de esta técnica, y continúa siendo utilizado para este propósito hoy en día. En la última década, el injerto ha atraído una cantidad creciente de atención como una herramienta para que los biólogos moleculares estudien la señalización a larga distancia en plantas 2,3,4,5. Si bien injertar plantas adultas es relativamente fácil, injertar plantas poco después de la germinación es un desafío. A pesar de esto, a veces se requiere evaluar los efectos de la señalización a larga distancia en procesos como el desarrollo de las plantas, las respuestas ambientales y la floración ^6,7,8.

Arabidopsis thaliana se ha establecido como el organismo modelo en biología vegetal por muchas razones, incluyendo su tamaño relativamente pequeño, lo que hace que sea fácil de cultivar dentro de un laboratorio. Sin embargo, el pequeño tamaño y la fragilidad de las plántulas de Arabidopsis hacen que el injerto de plántulas jóvenes sea muy difícil. En muchos casos, se requiere una amplia capacitación práctica para obtener con éxito los injertos de plántulas. Ha habido muchas mejoras metodológicas a lo largo de los años que han identificado condiciones ideales de crecimiento y nuevas técnicas para aumentar la tasa de éxito del injerto de plántulas 9,10,11. La herramienta más reciente introducida fue un chip de injerto de plántulas de Arabidopsis, que permite incluso a los usuarios inexpertos alcanzar niveles aceptables de éxito del injerto¹². Si bien este avance ha reducido significativamente la barrera técnica del injerto de plántulas, el dispositivo de chip es costoso y la cantidad de injertos que se pueden realizar en paralelo rápidamente se vuelve prohibitiva.

Además, este dispositivo solo se puede usar para plántulas de Arabidopsis que tienen dimensiones de hipocótilo similares a las plántulas de tipo silvestre. Si bien Arabidopsis es la especie clave en el mundo de la genética molecular de plantas, se han realizado trabajos recientes en otras especies utilizando injertos de plántulas. Los ejemplos incluyen el injerto de soja y frijol común, tabaco a tomate y canola a Arabidopsis, y posteriormente muestreo de ambos tejidos para pequeños ARN^13,14. Por lo tanto, un método de injerto que sea accesible para la mayoría de los laboratorios y que pueda adaptarse fácilmente a una amplia gama de especies de plantas sin ningún cambio importante en la técnica es altamente deseable.

Este protocolo detalla un método que emplea la producción interna de un dispositivo de injerto simple que permite la personalización completa del diámetro y la longitud del canal de injerto para acomodar cualquier morfología de plántula en la mayoría de las especies de plantas. La producción de estos dispositivos es muy asequible y altamente escalable, ya que los únicos componentes necesarios son elastómero de silicona, cableado o tubería del tamaño correcto, una cuchilla de alta precisión y un contenedor para servir como molde. Siguiendo el protocolo de injerto detallado aquí, los usuarios pueden lograr tasas de injerto exitosas del 45% (n = 105), comparables con los resultados de injerto informados anteriormente^10,12.

Protocolo

1. Preparación del dispositivo

1. Haga el dispositivo de injerto de silicona fundiendo una solución de elastómero de silicona en una placa de Petri cuadrada (100 mm x 100 mm). Prepare 15 ml de la solución de elastómero, siguiendo las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Los kits de elastómero de silicona generalmente incluyen un líquido a base de silicona y un agente de curado, que cuando se mezclan permiten que la silicona se solidifique.
2. Prepare la placa de Petri cuadrada colocando cuatro piezas rectas de alambre de 29 G en la placa de Petri cuadrada, equidistantes entre sí (Figura 1A). Asegúrese de que el cable quede al ras con la parte inferior del molde. Para enderezar completamente el alambre, enróllelo sobre una superficie dura y uniforme con un objeto pesado y plano (p. ej., una rejilla para tubos de metal).
   NOTA: Las bridas giratorias a menudo contienen alambre de 29 G y se pueden usar después de quitar el recubrimiento exterior de papel con acetona.
3. Vierta la solución de elastómero de silicona mixta sobre los cables y cubra con la parte superior de la placa de Petri. Deje que la silicona se cure durante 24-48 h a temperatura ambiente.
4. Retire la lámina de silicona de la placa de Petri con pinzas limpias y muévala a una superficie plana y limpia.
5. Retire los cables de la lámina de silicona. Retire la capa delgada de silicona que queda en el exterior del canal con pinzas de punto fino, para permitir que el canal se abra por un lado (Figura 1A).
6. Corte la lámina de silicona perpendicularmente a los canales en tiras de 3 mm con tijeras limpias. Mueva cada tira a un sobre de papel de aluminio y selle con cinta de autoclave.
7. Esterilizar en autoclave las tiras a 121 °C durante al menos 30 min y conservar hasta que estén listas para su uso.

2. Preparación de plántulas

1. Esterilizar y vernalizar las semillas.
   1. Suspender hasta 100 semillas de Arabidopsis en 1 ml de solución de lejía al 50% que contenga 0,1% de Tween 20 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e incubar durante 5-10 min. Retire la solución de lejía mediante pipeteo o aspiración en condiciones estériles. Enjuague las semillas con 1 ml de dH₂O esterilizado. Asegúrese de invertir los tubos para enjuagar adecuadamente las semillas y eliminar cualquier solución de lejía que quede en la parte superior del tubo. Repita el enjuague 4x.
   2. Dejar aproximadamente 0,25 ml de agua en los tubos con las semillas y almacenar a 4 °C durante 3 días en la oscuridad.
2. Coloque las semillas en preparación para el injerto.
   1. Prepare una placa MS de agar al 1% de la siguiente manera: para 1 L de MS (0.5% sacarosa) medio sólido, mezcle 4.4 g de sal MS, 5 g de sacarosa y 10 g de agar en 800 ml de agua, ajuste el pH a 5.7 con KOH y luego lleve el volumen total a 1 L con agua adicional. Autoclave durante al menos 20, min antes de verter ~ 25 ml en las placas de Petri cuadradas.
   2. En condiciones estériles, mueva el número apropiado de semillas preparadas al plato, utilizando una punta de pipeta de 20 μL para aspirar y transferir las semillas.
   3. Coloque una tira estéril en la superficie de la placa para guiar el posicionamiento de la semilla, de modo que las semillas estén alineadas con los canales de la tira. Retire la tira una vez que las semillas estén plateadas.
      NOTA: Una placa cuadrada de 100 mm x 100 mm puede acomodar dos filas de plántulas (Figura 1B).
   4. Una vez que las placas estén en pie, permita que el líquido se evapore del medio sólido y se acumule en el fondo de la placa. Después de colocar las semillas en el plato, coloque la tapa de la placa y selle un lado de la placa que esté paralelo a las dos filas de semillas (indicado por la región resaltada en azul en la Figura 1B) con parafilm. Envuelva cinta transpirable en la parte superior del parafilm y alrededor de todos los demás bordes de la placa.
3. Levante con cuidado dos placas con el lado sellado con parafilm hacia abajo. Separe las dos placas en la parte inferior colocando un tubo centrífugo horizontal de 15 ml entre ellas y asegúrelas con una banda elástica. Asegúrese de que las superficies de la placa formen un ángulo de 100°-110° con la superficie de sobremesa (Figura 1C).
4. Almacene las placas en esta orientación durante 72 h en total oscuridad a 21 °C, para permitir que los hipocótilos de las plántulas crezcan ~ 5 mm de longitud. Después de 72 h, retire las placas de la oscuridad y crezca bajo 16 h de luz (intensidad de 100 μE m-2 sec-1) y ciclos de oscuridad de 8 h durante ^2-4 días más a la misma temperatura antes del injerto.
5. Injertar las plántulas entre 5 y 7 días después de haber sido plateadas. Coloque una tira de injerto sobre las plántulas, encajando sus hipocótilos en los canales. Coloque suavemente la plántula de modo que la unión raíz-hipocótilo se coloque en la parte inferior de la tira de silicona para preparar la plántula para el corte (Figura 1D).

3. Procedimiento de injerto

1. Prepare un ambiente de trabajo estéril desinfectando un endoscopio de disección con etanol al 70% y esterilizando en autoclave dos pares de pinzas de punta fina y un mango de bisturí. Realice todos los procedimientos de injerto en una campana estéril y con la ayuda de un endoscopio de disección según sea necesario. Realice la mayor parte del injerto con un aumento de 10.5x.
2. Prepara los vástagos. Use una cuchilla de bisturí fresco para cortar el hipocótilo perpendicularmente para crear un corte limpio y recto. Empuje la cuchilla hacia adelante en lugar de presionar hacia abajo en la planta para evitar que la plántula sea empujada hacia el agar (Video 1).
3. Retire el brote. Tenga cuidado de mantener hidratada la parte cortada del brote asegurando el contacto con la superficie del medio. Alternativamente, mueva el brote a un área de retención designada, como la parte superior de una placa de Petri llena de dH₂O estéril, hasta que esté listo para su uso.
4. Preparar los portainjertos. Tire suavemente de la raíz atrapando la raíz en el espacio que queda entre las pinzas cerradas y girándolas, dejando la sección cortada de los portainjertos en el medio de la tira (Video 2).
   NOTA: La raíz frágil se dañará si se aplasta entre las pinzas cerradas directamente, lo que requiere encajar la raíz en el ángulo agudo de los extremos de la pinza para manipular el tejido.
5. Levante suavemente el brote deseado con las pinzas de punta fina e insértelo en la parte superior del canal.
   NOTA: Es fundamental confirmar visualmente el contacto entre los vástagos y los portainjertos para obtener un injerto exitoso (Video 3).
6. Después de que se hayan hecho todos los injertos, envuelva las placas con parafilm y cinta transpirable y coloque las placas de la misma manera que antes, sin alterar las plántulas o las tiras de silicona. Mover con cuidado las placas a una cámara de crecimiento fijada a 26 °C con ciclos de luz/8 h de oscuridad.
7. Evalúe las plántulas injertadas en condiciones estériles después de 7-10 días. Retire con cuidado la tira de silicona con pinzas pelando un lado, permitiendo que los canales liberen las plántulas. Retire cualquier raíz adventicia que crezca del vástago cortándolas del vástago con una hoja de bisturí fresco o aplastándolas con pinzas de punta fina. Evalúe visualmente si el portainjerto se ha unido firmemente al vástago para formar un injerto exitoso (Figura 2).
8. Mueva los injertos exitosos al suelo de propagación de plántulas para que crezcan durante el tiempo que sea necesario. Cubra el suelo con plástico transparente durante unos días a medida que las plántulas se establezcan. Después de transferir las plantas al suelo, cultive bajo los ciclos de luz y oscuridad mencionados anteriormente a 21 ° C.

Resultados

Se probaron varios aspectos del diseño de la tira de injerto para identificar las condiciones óptimas de injerto que requerían la menor cantidad de habilidad técnica (Tabla 1). Todos los ensayos de injerto se completaron en medio MS de sacarosa al 0,5%, que se ha informado previamente como un medio de injerto ideal^11,12.

El crecimiento óptimo de las plántulas no se puede lograr con la germinación en la t...

Discusión

Resumen y significado
La formación de una unión de injerto es crucial para el injerto exitoso, que requiere un contacto directo y sin interrupciones entre el portainjerto y el vástago. El tamaño en miniatura y la fragilidad de las plántulas de plantas pequeñas como Arabidopsis hacen que sea técnicamente difícil cumplir con este requisito. Una técnica desarrollada en los primeros métodos de injerto de plántulas de Arabidopsis fue insertar tanto el vástago como el portainje...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580