Hipertermia generada por ultrasonido focalizado de alta intensidad guiada por resonancia magnética: un método de tratamiento factible en un modelo de rabdomiosarcoma murino

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para usar hipertermia controlada, generada por ultrasonido enfocado de alta intensidad guiado por resonancia magnética, para desencadenar la liberación de fármacos de liposomas sensibles a la temperatura en un modelo de ratón rabdomiosarcoma.

Resumen

El ultrasonido focalizado de alta intensidad guiado por resonancia magnética (MRgHIFU) es un método establecido para producir hipertermia localizada. Dada la modulación de imágenes en tiempo real y la energía acústica, esta modalidad permite un control preciso de la temperatura dentro de un área definida. Se están explorando muchas aplicaciones térmicas con esta tecnología no invasiva y no ionizante, como la generación de hipertermia, para liberar medicamentos de portadores liposomales termosensibles. Estos fármacos pueden incluir quimioterapias como la doxorrubicina, para la cual se desea una liberación dirigida debido a los efectos secundarios sistémicos limitantes de la dosis, a saber, la cardiotoxicidad. La doxorrubicina es un pilar para tratar una variedad de tumores malignos y se usa comúnmente en el rabdomiosarcoma recidivante o recurrente (RMS). El RMS es el tumor extracraneal de tejido blando sólido más común en niños y adultos jóvenes. A pesar de la terapia agresiva y multimodal, las tasas de supervivencia del RMS se han mantenido iguales durante los últimos 30 años. Para explorar una solución para abordar esta necesidad no satisfecha, se desarrolló un protocolo experimental para evaluar la liberación de doxorrubicina liposomal termosensible (TLD) en un modelo de ratón RMS inmunocompetente y singénico utilizando MRgHIFU como fuente de hipertermia para la liberación del fármaco.

Introducción

El rabdomiosarcoma (RMS) es un tumor del músculo esquelético que ocurre con mayor frecuencia en niños y adultos jóvenes¹. La enfermedad localizada a menudo se trata con tratamiento multimodal, que incluye quimioterapia, radiación ionizante y cirugía. El uso de regímenes de quimioterapia con múltiples fármacos es más prevalente en pacientes pediátricos, con mejores resultados en comparación con sus contrapartes adultas²; Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de investigación en curso, la tasa de supervivencia a 5 años se mantiene en alrededor del 30% en la forma más agresiva de la enfermedad ^3,4. El estándar de atención de quimioterapia es un régimen de múltiples fármacos que incluye vincristina, ciclofosfamida y actinomicina D. En casos de enfermedad recidivante o recidivante, se utilizan quimioterapias alternativas, incluyendo doxorrubicina (DF) estándar (libre) e ifosfamida¹. Si bien todas estas quimioterapias tienen toxicidades sistémicas, la cardiotoxicidad de la doxorrubicina impone una limitación de dosis de por vida ^5-7. Para aumentar la cantidad del fármaco administrado al tumor y minimizar la toxicidad sistémica, se han desarrollado formulaciones alternativas, incluida la encapsulación liposomal. Estos pueden ser doxorrubicina no termosensible, que ha sido aprobada para el tratamiento del cáncer de mama y el carcinoma hepatocelular, o doxorrubicina termosensible, para la cual se están realizando ensayos clínicos 8,9,10,11,12,13. Se han evaluado métodos alternativos para administrar fármacos encapsulados liposomales, como liposomas multivesiculares y liposomas dirigidos a ligandos, que son prometedores para el tratamiento de tumores⁹. En este estudio, la adición de calor tiene impactos multifactoriales, incluyendo la liberación del fármaco¹⁴. La combinación de hipertermia (TH) generada con ultrasonido focalizado de alta intensidad guiado por resonancia magnética (MRgHIFU) y doxorrubicina liposomal termosensible (TLD) es un nuevo enfoque terapéutico multimodal para usar este fármaco tóxico pero efectivo para tratar el RMS, al tiempo que minimiza la toxicidad limitante de la dosis y aumenta potencialmente la respuesta inmune al tumor.

La doxorrubicina se libera rápidamente de TLD a temperaturas >39 °C, muy por encima de la temperatura promedio del cuerpo humano de 37 ° C, pero no lo suficientemente alta como para causar daño tisular o ablación; esto comienza a ocurrir a 43 ° C, pero ocurre más rápidamente a medida que las temperaturas se acercan a 60 ° C¹⁵. Se han utilizado varios métodos para generar HT in vivo, incluyendo láseres, microondas, ablación por radiofrecuencia y ultrasonido focalizado, muchos de los cuales son métodos de calentamiento invasivos¹⁶. MRgHIFU es un método de calentamiento no invasivo y no ionizante que facilita los ajustes precisos de temperatura dentro del tejido objetivo in situ. La resonancia magnética (RM) proporciona imágenes cruciales en tiempo real, donde se puede usar software de computadora, para calcular una medición de termometría del tejido durante todo el tratamiento; Posteriormente, estos datos se pueden utilizar para controlar la terapia de ultrasonido en tiempo real para alcanzar y mantener un punto de ajuste de temperatura deseado¹⁷. MRgHIFU ha sido probado en varios tipos de tejidos y puede ser utilizado para una amplia gama de tratamientos de temperatura, desde HTA leve hasta ablación, así como clínicamente para tratar con éxito metástasis óseas dolorosas¹⁸. Además, se ha demostrado que la TH causa citotoxicidad tumoral, modula la expresión de proteínas y altera la respuesta inmune en el microambiente tumoral 19,20,21,22. Un estudio combinó TH leve con TLD, seguida de ablación con MRgHIFU, en una rata sinérgica R1 modelo²³, lo que resultó en necrosis en el núcleo tumoral y administración del fármaco a la periferia. Tradicionalmente, la radioterapia se ha utilizado como terapia complementaria para dañar las células tumorales y disminuir la recurrencia local de la enfermedad. Sin embargo, su uso está limitado por la dosificación de por vida y el daño fuera del objetivo¹. Por lo tanto, la HTA es única en el sentido de que puede causar algunos de los mismos efectos sin las mismas toxicidades o limitaciones.

Los modelos animales preclínicos para RMS incluyen modelos inmunocompetentes singénicos y xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) en huéspedes inmunocomprometidos. Mientras que los modelos inmunocomprometidos permiten el crecimiento de los tumores humanos, carecen del microambiente tumoral apropiado y están limitados en su capacidad para estudiar la respuesta inmune²⁴. La mutación activadora de FGFR4 es un marcador prometedor de mal pronóstico y una posible diana terapéutica en RMS adultos y pediátricos ^1,25. En los modelos RMS singénicos desarrollados en el laboratorio de Gladdy, los tumores son capaces de crecer en un huésped inmunocompetente, que desarrolla respuestas inmunes innatas y adaptativas al tumor²⁶. Como la TH influye en la respuesta inmune, la observación del cambio en la respuesta inmune murina es una ventaja valiosa de este modelo tumoral. Para probar tanto la respuesta tumoral a TLD en comparación con FD, como el cambio en la respuesta inmune del tumor tanto a la quimioterapia como a la TH, se desarrolló y empleó un protocolo para tratar los tumores murinos singénicos de RMS in vivo utilizando MRgHIFU y TLD, que es el foco de este estudio.

Protocolo

La investigación se realizó de acuerdo con los comités de cuidado de animales con protocolos aprobados de uso de animales bajo un veterinario supervisor en las instalaciones de investigación animal del Centro de Fenogenómica (TCP) y del Centro de Recursos Animales (ARC) de la Red de Salud Universitaria (UHN). Todos los procedimientos, excluyendo el MRgHIFU, que involucran a los animales se realizaron en un gabinete de seguridad biológica (BSC) para minimizar la exposición de los animales al aire externo o infección susceptible.

1. Cría de ratones

NOTA: Un total de 65 ratones (cepa B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) fueron incluidos en el estudio piloto (macho: n = 23; hembra: n = 42). Tanto los ratones machos como las hembras se utilizaron a las 7-9 semanas de edad. Sus cachorros fueron destetados y genotipados, y los ratones heterocigotos p53 fueron utilizados para los experimentos.

1. Aloja dos ratones hembra con cada ratón macho para crear jaulas de cría. Cuente las edades de sus cachorros desde el nacimiento (nacimiento = día 0).
2. En el día 10, identifique a los cachorros con una muesca en la oreja. Recoja los cortes de cola para el genotipado antes de la inyección de la línea celular.

2. Genotipado del ratón

1. Extraiga el ADN de los recortes de cola de 2 mm recolectados utilizando un kit comercial de extracción de ADN (consulte la Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Determine la concentración y pureza de ADN midiendo la absorbancia a 260-280 nm en un espectrofotómetro (ver Tabla de materiales).
3. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
   1. Cree una mezcla maestra que contenga una mezcla comercial de PCR (que contenga polimerasa Taq, dNTPS y MgCl 2; consulte la Tabla de materiales), cebador y dH₂O en una proporción de 12.5:0.25:10.75 (μL) para el número requerido de muestras. Agregue 1 μL de muestra de ADN a cada tubo de PCR e incluya dH₂O, una muestra nula (homocigota para la mutación p53), una muestra heterocigótica (heterocigota para la mutación p53) y una muestra de tipo salvaje (homocigota para p53 normal) como controles de PCR.
   2. Agregue 24 μL de la mezcla maestra a cada tubo de PCR que contenga ADN. Pipetear la solución en cada tubo de PCR hacia arriba y hacia abajo para distribuir el ADN por toda la mezcla maestra.
   3. Coloque los tubos de reacción en un termociclador y realice un ciclo de acuerdo con las siguientes especificaciones: 95 °C durante 2 min, 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 15 s y 72 °C durante 1 min, y luego mantener a 4 °C hasta que esté listo para analizar en el gel.
4. Analizar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa.
   1. Preparar un gel al 2% (50 mL de 1x TAE y 1 g de agarosa) calentando la agarosa en el TAE y mezclando hasta que se disuelva. Cuando se enfríe y aún esté líquido, agregue 2.5 μL de tinción de gel de ADN a la agarosa y mezcle. Echa el gel en una caja de gel con un peine. Coloque el gel en el aparato electroforético (ver Tabla de materiales) y cubra con 1x TAE.
   2. Cargue 10 μL de 1 kB DNA Ladder en el gel. Cargar 12,5 μL de cada muestra. Hacer correr el gel durante 25 minutos a 135 V.
   3. Imagine el gel utilizando la configuración adecuada para la tinción de gel de ADN utilizada en un generador de imágenes de gel (consulte la Tabla de materiales), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

3. Preparación del modelo tumoral (Figura 1)

1. Cultivar la línea celular M25FV24C (pasaje 12-15) 1 semana antes de la fecha de inyección en medios de crecimiento completos (Eagle Medium [DMEM] modificado de Dulbecco con aditivos: 10% FBS, 1% Penicilina/Estreptomicina y 2 mM L-alanil-L-glutamina dipéptido) en un matraz de 75 ml, a 37 °C y 5%_CO2. Una vez que las células estén ~ 80% confluentes, aspire los medios y lave las células 1x con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
   NOTA: M25FV24C es una línea celular murina diseñada para sobreexpresar el mutante FGFR4^V550E, que se observa en RMS ^1,26 pediátrico y adulto.
2. Levante las células agregando 0.5 ml de solución de tripsina al 0.25% al lado de la placa e incubando el recipiente durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. Una vez que las células parezcan desprendidas, agregue 2.5 ml de medios de crecimiento completos a temperatura ambiente para inactivar la tripsina. Utilice una alícuota de muestra de 10 μL para determinar la concentración celular de células viables utilizando un hemocitómetro y una exclusión de azul de tripano.
3. Preparar el volumen correcto de células suspendidas con DPBS para inyección y colocarlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml: volumen a centrífuga = (número de ratones × número de células por ratón)/ (concentración de células), donde el número de ratones = los ratones a inyectar + 10 ratones adicionales por error, y el número de células por ratón = 10⁴.
4. Centrifugar durante 5 min a 153 x g. Resuspender el pellet celular en el volumen apropiado (10 μL por ratón × número de ratones) de tampón de mioinyección (medio F10 + 0,5% FBS) e inyectar los ratones dentro de 1 h de preparación de esta suspensión.

4. Inyección intramuscular de células

NOTA: Las células M25FV24C se inyectan en la extremidad posterior derecha de ratones entre 4 y 6 semanas de edad. La inyección a las 4 semanas produce un ratón pequeño con un tumor que puede ser más difícil de tratar ya que hay menos tejido circundante para la dispersión de HT; Esperar hasta las 6 semanas produce un ratón más grande, lo que facilita el tratamiento del tumor.

1. Invierta la suspensión celular varias veces antes de la aspiración para ayudar a distribuir uniformemente las células dentro de la solución. Aspirar 10 μL (10⁴ células) con una jeringa de microlitro (ver Tabla de materiales). Scruff el ratón; Una vez restringido, el acceso a los músculos caudales del muslo se puede obtener extendiendo la pata trasera. Afeite la pierna con tijeras y limpie con etanol al 70%.
2. Inyecte la suspensión celular M25FV24C (10 μL, 10 4 células) en la musculatura del muslo de la extremidad posterior derecha de un ratón de⁴ a 6 semanas de edad utilizando una jeringa de microlitros hermética al gas con una aguja de 26s G.
   NOTA: La aguja debe insertarse paralela al fémur hacia la rodilla, teniendo cuidado de no golpear el nervio ciático. Inserte solo la punta de la aguja (aproximadamente 2 mm) debido a la pequeña masa muscular de la extremidad posterior.
3. Administre la solución en un movimiento constante. Retire la aguja y asegúrese de que no se produzca sangrado. Devuelva el ratón a una segunda jaula.
4. Evalúe a los animales diariamente y controle sus extremidades posteriores para detectar el crecimiento del tumor a través de la palpación. Eutanasia a los ratones usando dióxido de carbono si se encuentra alguno de los siguientes puntos finales tempranos: tamaño del tumor superior a 1,5 cm de diámetro, ulceración tumoral o signos sistémicos de enfermedad (piloerección, postura encorvada, inactividad o disminución de la ingesta de alimentos o agua).

5. Detección de resonancia magnética

1. Anestesiar al ratón, a un nivel donde no haya movimiento con apretar la pata, con isoflurano bajo los siguientes parámetros: inducir en una cámara con 4% a 1.5 LPM, luego transferir al cono de la nariz en el trineo del escáner de resonancia magnética y continuar el mantenimiento de isoflurano en el cono de la nariz con 1.5% -2% a 0.75 LPM. Conecte el monitor respiratorio. Use ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
2. Imagen del ratón anestesiado usando el escáner de resonancia magnética (consulte la Tabla de materiales). En la imagen ponderada en T2 (adquisición Ax_Screen, Tabla 1), tome nota de las dimensiones en el plano y el número de cortes axiales en los que aparece el tumor. Tenga en cuenta la ubicación del tumor en referencia al fémur y la superficie lateral del muslo, donde entraría la onda de ultrasonido.
   NOTA: El tumor aparece como una masa hiperintensa dentro del músculo que es asimétrica desde el lado opuesto. Un buen tamaño inicial del tumor para tratamientos múltiples es de 2 mm x 2 mm x 2 mm para estudios agudos o de supervivencia. Si es mucho más grande, solo será bueno para estudios agudos, ya que el tumor alcanzará un punto final de tamaño antes de completar tres tratamientos semanales. Los criterios de exclusión para el tratamiento HIFU incluyen: envuelto alrededor del fémur, demasiado cerca del fémur, demasiado posterior en el ratón, medial al fémur, demasiado cerca del recto.
3. Retire el ratón del escáner y obtenga un peso de referencia. Afeite al ratón desde la mitad del cuerpo hasta los pies bajo anestesia con una afeitadora eléctrica.
   NOTA: Idealmente, el afeitado se realiza 1 día antes del tratamiento, ya que permite que el ratón realice el aseo, lo que permite que la crema depilatoria funcione de manera más eficiente.
4. Recupere el ratón en el BSC, utilizando una almohadilla térmica debajo de un extremo de la jaula. Devuelva el ratón a su jaula cuando recupere la decúbito esternal.

6. Experimento: preparación animal del día de tratamiento HIFU

1. Para preparar el sistema HIFU (ver Tabla de materiales) de pequeño calibre, encienda el generador y llene el transductor con suficiente agua desionizada hasta que la membrana se expanda por debajo del transductor, pero no tan firme como para comprimir el ratón. Desgasifique el agua en el circuito del transductor durante 30 minutos para eliminar el oxígeno disuelto del medio.
2. Prepare el sistema informático asociado.
   1. Encienda el ordenador de control y asegúrese de que esté conectado a través de Ethernet al generador HIFU y a través de USB a la pantalla de la sonda térmica. Inicie el software y haga clic en Inicio para iniciar el transductor antes de insertar el mouse.
   2. Calibre las sondas térmicas de fibra óptica: obtenga las temperaturas ambiente de referencia y anote el cambio de temperatura en la sala de resonancia magnética. Tenga en cuenta la magnitud de la deriva de temperatura para cada sonda debido a la intensidad del campo magnético. Inserte la sonda de temperatura del tubo de deriva en un tubo de vidrio lleno de gadolinio para calibrar la temperatura durante el escaneo y asegure el tubo de deriva con cinta adhesiva.
      NOTA: La temperatura ambiente de referencia (tubo de deriva) se agrega manualmente como un parámetro de termometría en la GUI en el software. Se establece una región de interés (ROI) dentro del tubo de deriva en la imagen de RM para detectar cualquier desviación de temperatura y corregirá automáticamente las imágenes de termometría.
   3. Extraiga el medicamento que se inyectará en una jeringa de 1 ml y colóquelo en la bomba de administración automática (consulte la Tabla de materiales). Prepare la línea que se conectará al catéter de la vena de la cola del ratón hasta que el medicamento haya llenado completamente la línea presionando el botón de administración manual en la bomba de administración automática.
   4. Use una lámpara de calor para calentar a los ratones en las jaulas durante ~ 20 minutos antes de transferirlos a la cámara anestésica.
      NOTA: El precalentamiento promueve la vasodilatación, que se encontrará tan pronto como el ratón esté anestesiado y ayude en la colocación del catéter.
3. Anestesiar al ratón con isoflurano (inducción: 4% a 1,5 LPM; mantenimiento: 1,5%-2% a 0,75 LPM) y transferir a un cono nasal. Aplique un lubricante corneal en los ojos para prevenir daños debido a la falta de reflejo de parpadeo bajo anestesia.
4. Aplique crema depilatoria en el área afeitada, incluyendo toda la extremidad posterior derecha, y siga las instrucciones del fabricante para la depilación.
   NOTA: Coloque el ratón bajo una lámpara de calor mientras está en el BSC para ayudar con la termorregulación durante la depilación bajo anestesia.
5. Después de lavar la crema depilatoria con agua tibia, pese el ratón en una balanza digital y registre la dosis del medicamento.
6. Mueva el mouse a un cono nasal compatible con MRI en el trineo de MRI. Coloque una lámpara de calor en el ratón para mantenerlo caliente mientras se prepara para la resonancia magnética. Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral con el lado sin cojinete tumoral hacia abajo y el tumor superior dentro de un soporte para ratón impreso en 3D en el trineo (Figura suplementaria 1 y Figura 2). Asegúrese de colocar correctamente el tumor (es decir, en el centro de la bobina horizontal y verticalmente, con la altura justo por encima de los bordes del soporte del ratón para tener en cuenta la compresión del transductor de ultrasonido).
   NOTA: Si es necesario, corte un segmento comprimido de almohadilla de gel de ultrasonido para colocarlo debajo del mouse, recubriendo la parte inferior del soporte, con un grosor para nivelar el tumor hasta la parte superior del soporte.
7. Coloque la pierna no involucrada lejos de la pierna del tumor, ya sea debajo del ratón o extendida con la pierna tumoral flexionada. Asegúrese de que los pies no estén en el campo cercano o lejano del tumor y la trayectoria del haz de ultrasonido. Coloque la lámpara de calor a 15 cm de la cola para calentar para la inserción del catéter en la vena de la cola.
8. Inserte la sonda de temperatura esofágica.
   1. Pase la sonda esofágica a través del cono de la nariz y frote el cuello del ratón. Incline la nariz del ratón hacia arriba para crear una línea desde su boca directamente hasta su estómago extendiendo la cabeza. Deslice la sonda térmica por encima de la lengua aproximadamente 0,5 cm en el esófago del ratón y reemplace el cono de la nariz alrededor de la nariz del ratón. Asegure la sonda esofágica y el cono de la nariz en la parte superior del trineo.
      NOTA: Controle los signos de dificultad respiratoria inmediatamente después de la inserción, ya que puede insertarse incorrectamente en la tráquea.
9. Inserte la sonda de temperatura rectal.
   NOTA: Las sondas de temperatura rectal y esofágica deben estar a menos de 3 °C una de la otra.
10. Coloque el monitor respiratorio con el cable de conexión hacia la cabeza del ratón para que no interfiera con la colocación del transductor de ultrasonido. Asegurar con cinta adhesiva.
11. Inserte un catéter de vena de cola con aguja de mariposa de 27 G en una vena lateral de la cola conectada a un microtubo con 20 μL de espacio muerto y cinta adhesiva de forma segura. Después de colocar la cinta adhesiva, asegúrese de que el catéter siga enjuagando bien.
12. Use dos personas para llevar el ratón preparado, el trineo del ratón, la línea de anestesia, la línea respiratoria, el catéter de la vena de la cola y los cables de la sonda térmica en el escáner de resonancia magnética, y colóquelos en el soporte del trineo de resonancia magnética.
13. Haga que el operador del software HIFU (consulte la Tabla de materiales) mueva el menisco del transductor directamente sobre el tumor mediante inspección visual para una alineación inicial²⁷. Aplique lubricante ocular o gel de ultrasonido desgasificado en la piel sin pelo por encima del tumor y acople el transductor HIFU al área del tumor.
14. Conecte la línea de administración de fármacos desde la bomba automática al catéter de la vena caudal. Calcule la cantidad de espacio muerto en la línea de la vena de la cola y la línea de conexión. Deslice el trineo HIFU del ratón sobre rieles de resonancia magnética en el centro de la resonancia magnética.
15. Establezca la cantidad de infusión de fármaco en la bomba, dependiendo del tipo y la concentración del fármaco y el peso del animal, y agregue la cantidad de espacio muerto. Ajuste la bomba a una velocidad de perfusión de 200 μL/min.
    NOTA: En este estudio, FD y TLD se utilizaron a una concentración de 2 mg / ml y una dosis de 5 mg / kg de peso corporal.
16. Registre las temperaturas de referencia de la sonda térmica.
17. Coloque el dispositivo de calentamiento por convección de aire (consulte la Tabla de materiales) en el ajuste más cálido. Apunte el tubo que sopla aire hacia el ratón en el centro del orificio de resonancia magnética y asegúrelo con cinta adhesiva. El dispositivo de calentamiento se girará más tarde a su configuración más baja (32 ° C) para evitar el sobrecalentamiento del mouse durante la sonicación.
18. Adquirir las imágenes de RM de la encuesta (Ax_Loc, Sag_Loc; Tabla 1) para determinar la ubicación del tumor para la sonicación dirigida, incluida la profundidad. Ajuste la posición del transductor en consecuencia utilizando el software HIFU insertando la distancia de movimiento deseada medida en la imagen y luego haciendo clic en la dirección de la flecha para moverse (Figura 3A). También tenga en cuenta la ubicación del tubo de deriva. Repita según sea necesario.
19. Determine la ubicación del punto focal del transductor en el plano coronal realizando una breve sonicación continua de "disparo de prueba" de amplitud de 5 s x 50 mV durante la adquisición de termometría Test_Shot (Tabla 1).
20. Alinee las imágenes de la encuesta MR con la vista coronal del punto focal dentro del software HIFU. Revise las imágenes para la ubicación del tumor, en relación con la estructura ósea y el recto, y revise el posicionamiento del transductor según se considere necesario.
21. Repita la sonicación de la toma de prueba durante las imágenes Therm de nueve repeticiones (Tabla 1) para confirmar si hay un calentamiento uniforme y preciso en el volumen del tumor con un calentamiento mínimo fuera del objetivo. Ajuste la ubicación del corte, la ubicación del transductor y la profundidad de la dirección, y confirme el rendimiento de calentamiento con "disparos de prueba" repetidos según se considere necesario.
22. Usando el software de monitoreo de tratamiento HIFU, defina el ROI para el monitoreo de termometría dentro del perfil de calentamiento final midiendo la distancia a mover y luego alterando las coordenadas de la cuadrícula en el programa. Establezca un ROI alrededor del tubo de deriva para la corrección de deriva. Introduzca la temperatura de referencia en función de la temperatura de la sonda rectal para las mediciones de termometría . El sistema HIFU se utiliza para iniciar la sonicación del tratamiento HIFU y para el monitoreo de la termometría.
23. Abra las especificaciones del tratamiento de hipertermia de 20 minutos en el software e inicie la sonicación una vez que se hayan recopilado las imágenes de RM de referencia y comience la termometría .
24. Realice un tratamiento de 20 minutos (Figura 3B) durante la obtención de imágenes Therm (Tabla 1) utilizando el software de controlador integrado de derivadas proporcionales (PID). Inyecte el medicamento seleccionado a 1,5 min, después de que la temperatura en el ROI se caliente a la temperatura deseada (40 ° C).
25. Controle la temperatura central durante todo el tratamiento. Si la temperatura rectal aumenta rápidamente durante el tratamiento, puede ser necesario reposicionar al ratón para evitar el calentamiento rectal durante los 10 o 20 minutos de duración del tratamiento. Interrumpir el tratamiento si la temperatura rectal aumenta a >40 °C.

7. Experimento: Procedimiento de sonicación e imagen de modelo de ratón para estudios agudos

1. Después de completar el tratamiento, retire el ratón del orificio de resonancia magnética, asegurando la hemostasia en el sitio de inserción del catéter de la vena de la cola. Transfiera el ratón al BSC y colóquelo en el cono de la nariz para continuar la anestesia.
2. Coloque el ratón boca arriba sobre una almohadilla absorbente azul con sus extremidades restringidas y el corazón expuesto.
3. Eutanasia a los ratones a través de la exanginación a través de la punción cardíaca seguida de la extirpación del corazón. Tome la sangre inmediatamente y centrifugar para la separación del plasma a 10,621 x g durante 10 min.
4. Realice necropsia y almacene los órganos según sea necesario para el análisis. Congelar los órganos en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C durante varios meses o a largo plazo en un tanque de nitrógeno líquido.
5. Homogeneice mecánicamente el tejido tumoral agregando un exceso de nueve veces (p/p) de agua desionizada y rompiendo el tejido usando un homogeneizador de batidor. Extraer doxorrubicina de 600 μL de tejido homogeneizado añadiendo secuencialmente 75 μL de 300 mg/ml de nitrato de plata, 75 μL de ácido sulfúrico 10 mM y 2,5 mL de isopropanol:cloroformo 1:1. Vortex durante 20 min y almacenar a -20 °C durante la noche.
6. Para preparar muestras para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), centrifugar la solución del paso 7.5 a 4.500 x g, eliminar la capa de disolvente orgánico y secar el isopropanol:cloroformo bajo una corriente de gas nitrógeno. Resuspender en 100 μL de 2:1 MeOH:_H2O. Medir la concentración de doxorrubicina utilizando HPLC-MS/MS²⁸.

8. Experimento: Procedimiento de sonicación e imágenes de modelos de ratón para estudios de supervivencia

NOTA: Para estudios de supervivencia, siga el procedimiento de preparación del animal de día de tratamiento HIFU (paso 6.1 a 6.25).

1. Después de completar el tratamiento, coloque al ratón bajo una lámpara de calor para permitir que se recupere, y controle su respiración y movimiento hasta que recupere la decúbito esternal. Luego, devuelva al animal a su jaula.
   NOTA: Asegúrese de que la mitad de la jaula esté en línea con una lámpara de calor, ya que la regulación térmica de los animales se ve afectada por la anestesia y el tratamiento de TH.
2. Controle a los ratones diariamente para determinar el comportamiento, los patrones de alimentación y la frecuencia respiratoria para detectar cualquier signo de angustia.
3. Realice tratamientos una vez a la semana siguiendo los pasos 6.1 a 6.25 durante 3 semanas consecutivas.
4. Dos veces por semana, realice imágenes de resonancia magnética de los ratones para la medición del tumor. Durante las semanas durante el tratamiento, realice una resonancia magnética y una ecografía cada semana. Después de completar el tratamiento, realice imágenes de ultrasonido quincenales.
5. Eutanasia al ratón 60 días después de completar la serie de tratamientos, o cuando se haya alcanzado un criterio de valoración humano (tamaño del tumor >1,5 cm³ o morbilidad del tumor), seguido de necropsia con extirpación de tumor y órgano para su análisis.

Resultados

Usando el protocolo de hipertermia generada por MRgHIFU, los tumores en la extremidad posterior pudieron calentarse consistentemente a la temperatura establecida deseada durante la duración del tratamiento (la Figura 4 muestra un tratamiento representativo, 10 o 20 min, n = 65). Para considerar que un tratamiento era exitoso, el ROI debía mantenerse por encima de 39 °C durante todo el tratamiento, con una variación de <6 °C a lo largo del tratamiento y sin calentamiento del tejido fuera...

Discusión

El protocolo desarrollado en la presente invención se utilizó para atacar tumores de las extremidades posteriores utilizando MRgHIFU para el tratamiento leve de TH y liberar fármacos encapsulados de liposomas in vivo. Se encontraron varios pasos críticos en este protocolo durante el estudio piloto, y la optimización de estos pasos críticos representó el éxito mejorado del tratamiento durante el estudio piloto. La primera es la eliminación completa del vello en la zona a sonicar. Cualquier atrapamiento d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 - 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08