Una determinación de disolución in vitro de componentes de múltiples índices en gránulos de Rhodiola de medicina tibetana

Resumen

Aquí, probamos la disolución de gránulos de Rhodiola (RG) in vitro, dibujamos curvas de disolución de salidroside, ácido gálico y galato de etilo en agua ultrapura, y ajustamos las curvas a diferentes modelos matemáticos. Este protocolo proporciona información y orientación para la bioequivalencia in vivo y los estudios de correlación in vivo-in vitro de RG.

Resumen

La composición de la medicina tibetana Rhodiola granules (RG) es compleja, y la calidad general de RG es difícil de determinar. Por lo tanto, establecer un método para determinar la disolución in vitro multicomponente de RG es de gran importancia para el control de calidad. Este estudio utiliza el segundo método de remo de la cuarta regla general 0931 de la Farmacopea China (edición 2020), compatible con el aparato 2 de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP). El aparato de disolución se ajustó a una velocidad de rotación de 100 rpm con agua ultrapura como medio de disolución. Se recogió un volumen de muestra de 1 ml en cada punto temporal. Además, la disolución acumulativa de ácido gálico, salidrosido y ácido gálico etílico en RG en diferentes puntos de tiempo se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Finalmente, se dibujaron las curvas de disolución y las curvas se ajustaron a las ecuaciones de GompertzMod, Gompertz, Logistic y Weibull. Los resultados mostraron que la disolución acumulada del ácido gálico en RG fue superior al 80% a 1 min, la disolución acumulada de salidroside y ácido etil gálico fue superior al 65% a los 5 min, y la disolución acumulada de cada componente del índice disminuyó después de 30 min. El ajuste de curva demostró que la ecuación de GompertzMod era el modelo de mejor ajuste para cada componente de índice de RG. En conclusión, el método de prueba de disolución descrito en este protocolo es simple, preciso y confiable. Se puede caracterizar el comportamiento de disolución de los componentes del índice en RG in vitro, lo que proporciona una referencia metodológica para el control de calidad de RG y la evaluación de la calidad de otros compuestos étnicos.

Introducción

En China, la prevalencia de enfermedades cardiovasculares sigue aumentando, y las tasas de morbilidad y mortalidad de las enfermedades cardiovasculares ocupan el primer lugar entre los residentes chinos¹. La angina de pecho de la enfermedad coronaria es causada por estenosis luminal debido a aterosclerosis coronaria, que conduce a un suministro de sangre coronaria relativamente insuficiente e isquemia miocárdica e hipoxia². En los últimos años, el efecto curativo de la medicina tradicional china en el tratamiento de la enfermedad coronaria ha sido reconocido por muchos médicos³.

La medicina tradicional china juega un papel importante en el alivio de los síntomas clínicos y la mejora de la calidad de vida de los pacientes⁴. Los gránulos de Rhodiola (RG) se extraen y refinan de la planta medicinal de la meseta tibetana Rhodiola rosea L. Los principales componentes de RG son salidroside, rhodiosin, y flavonoides ^5,6. RG tiene el efecto de complementar Qi⁷ y activar y promover la circulación sanguínea para aliviar el dolor. Clínicamente, se utiliza para tratar obstrucciones torácicas causadas por deficiencia de Qi y estasis sanguínea, enfermedad coronaria, angina de pecho⁸. La determinación del contenido por sí sola no refleja completamente la calidad intrínseca de los medicamentos, ya que tanto la desintegración como la disolución in vitro pueden afectar la biodisponibilidad y eficacia de los medicamentos ^9,10. Los métodos de inspección para la disolución de la medicina china incluyen el método de la cesta giratoria, el método de la paleta y el método de la taza pequeña. La desventaja del método de la cesta giratoria es que solo la parte exterior de la cesta giratoria entra en contacto con el medio de disolución durante la rotación, lo que no refleja el comportamiento de disolución del mundo real. El método del remo puede superar las deficiencias anteriores, lo que lo hace más adecuado que el método de la canasta para algunas preparaciones sólidas de medicina china¹¹. En la actualidad, no hay ningún informe sobre el análisis de disolución in vitro de RG. Con el fin de controlar la calidad de RG de manera más integral, se investigó el comportamiento de disolución de los tres componentes del índice (ácido gálico, salidroside y galato de etilo) en RG. Este estudio proporciona datos para el control de calidad de RG y una referencia metodológica para la evaluación de la calidad de otras preparaciones de compuestos étnicos.

Protocolo

1. Preparación de la solución

1. Preparar la solución madre de la sustancia de referencia: Pesar 10,6 mg de salidroside, 5,24 mg de ácido gálico y 5,21 mg de ácido etílico gálico por separado en una balanza analítica electrónica y añadirlos individualmente en un matraz aforado de 5 ml. Luego, agregue metanol de grado HPLC para disolver y diluir a 5 ml. Finalmente, agitar bien para obtener la solución madre de la sustancia de referencia con concentraciones másicas de 2,120 mg/ml, 1,048 mg/ml y 1,042 mg/ml, respectivamente.
   NOTA: La solución madre de la sustancia de referencia contiene 2,120 mg/ml de salidroside, 1,048 mg/ml de ácido gálico y 1,042 mg/ml de galato de etilo como solución madre de cada solución en la curva patrón siguiente.
2. Prepare la solución de muestra de prueba. Extraiga 2,8 g de RG (Tabla de materiales) con 10 ml de metanol de grado HPLC utilizando una máquina de limpieza ultrasónica (potencia: 200 W, frecuencia: 40 kHz) durante 30 min, y luego filtre con un filtro de 0,22 μm para la prueba de adaptabilidad del sistema.
3. Prepare una solución mixta de referencia que contenga 0,590 mg/ml de salidroside, 2,030 mg/ml de ácido gálico y 1,930 mg/ml de galato de etilo.
   NOTA: Cada patrón (2,950 mg de salidroside, 10,150 mg de ácido gálico y 9,650 mg de ácido gálico etílico) se disuelve en un matraz aforado de 5 ml en metanol de grado HPLC como medio de disolución.
4. Obtener el contenido teórico de cada componente característico de RG para la extracción de agua ultrapura.
   1. Introducir 2,8 g de RG en un matraz cónico de 500 ml, añadir 200 ml de agua ultrapura y extraer por ultrasonidos (potencia: 200 W, frecuencia: 40 kHz) durante 60 min. Luego, fílvelo con un filtro de 0.22 μm.
   2. Determine el contenido de la solución de prueba de acuerdo con la ecuación lineal obtenida en el siguiente experimento.

2. Estado cromatográfico

1. Establezca las condiciones cromatográficas como se muestra en la Tabla 1 para la cromatografía líquida de alta resolución. Para obtener detalles sobre el instrumento utilizado, consulte la Tabla de materiales.

3. Prueba de adaptabilidad del sistema

1. Investiga la relación lineal.
   1. Diluir las soluciones madre de referencia de ácido gálico y galato de etilo en 5, 10, 25, 50 y 125 veces, y las soluciones madre de referencia de salidroside en 2, 4, 8, 16 y 32 veces para obtener la solución de concentración de gradiente para dibujar una curva estándar.
      NOTA: Ajuste la relación de dilución de la curva estándar de acuerdo con el experimento preliminar del tratamiento de la muestra. En el experimento preliminar, las soluciones madre de los tres patrones se diluyeron primero 5, 10, 25, 50 y 125 veces, y luego se trazó la primera curva estándar. Sin embargo, cuando se detectó la concentración de la muestra problema, se encontró que las concentraciones de salidroside no caían dentro del rango lineal de esta curva estándar y, por lo tanto, las concentraciones se ajustaron para incluirlas en la curva. En resumen, los experimentos preliminares anteriores se utilizaron para determinar las concentraciones finales de dilución de las tres muestras de prueba para estudios experimentales posteriores.
2. Pruebas de precisión: Inyecte 10 μL de la solución de referencia mezclada en el sistema de HPLC seis veces al día y ejecute las muestras con las mismas condiciones de HPLC descritas en el paso 2.1. Registre el área máxima de cada componente de entidad.
3. Experimentos de pruebas de estabilidad: Inyectar 10 μL de la solución de muestra preparada y determinar las áreas pico de la HPLC de acuerdo con las condiciones cromatográficas después de 0 h, 6 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h y 24 h, respectivamente.
   NOTA: Las áreas pico son registradas automáticamente por el sistema HPLC.
4. Prueba de reproducibilidad: Tomar seis muestras del mismo lote de RG para preparar la solución de muestra de ensayo según el método del paso 1.2. Inyecte 10 μL de cada muestra en el sistema de HPLC. Ejecute los ejemplos como se describe en el paso 2.1 y determine la reproducibilidad.
   NOTA: La repetibilidad se evaluó comparando las diferencias de concentración entre las seis muestras.
5. Experimento de recuperación
   1. Prepare seis porciones del mismo lote de RG para la solución de prueba. Luego, agregue aproximadamente el 50% de la sustancia de referencia de cada componente del índice en la solución de prueba para calcular la tasa de recuperación. Ejecute estos ejemplos en el sistema HPLC con las mismas condiciones descritas en el paso 2.1.
   2. Calcule la tasa de recuperación.
      NOTA: Tasa de recuperación = (C - A) / B x 100, donde A es la cantidad de componente que debe medirse en la solución de ensayo, B es la cantidad de sustancia de referencia añadida y C es el valor medido de la solución que contiene la sustancia de referencia y la muestra RG. Consulte el paso 2.1 para conocer las condiciones cromatográficas para realizar los pasos anteriores (es decir, los pasos 3.1-3.5).

4. Ensayo de disolución in vitro

1. Realizar la prueba de disolución utilizando el método de paleta del segundo método de la regla general 0931 de la Farmacopea China (edición 2020)¹².
   NOTA: Técnica y equipo de muestreo: El aparato de disolución de fármacos (Tabla de materiales) tiene una copa de disolución, una paleta, un sistema de control de temperatura y un sistema de ajuste de velocidad. Antes de comenzar el experimento de disolución, el agua se precalienta a una temperatura establecida y luego se establece la velocidad correspondiente. Comience a registrar el tiempo inmediatamente después de agregar RG.
2. Añadir 100 ml de agua ultrapura en el vaso de disolución del aparato de disolución del fármaco y mantener la temperatura a 37 °C ± 0,5 °C. Ajuste la velocidad de rotación a 100 rpm.
   NOTA: El aparato de disolución tiene un dispositivo de calentamiento que permite ajustar la temperatura dentro del sistema. No hubo diferencia significativa en la velocidad de disolución de salidroside en agua, jugo gástrico artificial (16,4 mL de ácido clorhídrico diluido [234 mL de ácido clorhídrico concentrado diluido a 1000 mL con agua] con aproximadamente 800 mL de agua y 10 g de pepsina, bien agitada, y diluida con agua a 1.000 mL), y jugo intestinal artificial (tampón fosfato [pH 6,8] que contiene tripsina)¹³. El agua más fácilmente disponible (ultrapura) fue seleccionada como medio de disolución.
3. Agregue 2.8 g de RG en una taza de disolución y comience a registrar la duración de la disolución inmediatamente. Recoja un total de 1 ml de la muestra con un inyector (consulte la Tabla de materiales) a 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min y 60 min, y enrase el volumen en la taza de disolución con el medio de disolución a la misma temperatura inmediatamente.
   NOTA: El tubo de muestreo en la copa de disolución no puede recoger pequeños volúmenes de muestra, por lo que el inyector se utiliza para recoger la muestra. Las muestras deben recogerse rápidamente para evitar perder puntos de tiempo de recolección especificados.
4. Filtrar inmediatamente las muestras recogidas a través de una membrana microporosa de 0,22 μm y tomar el filtrado posterior. Determine el contenido de cada componente en cada punto de tiempo mediante HPLC (según el paso 2.1) y calcule la disolución acumulativa.
   1. Para calcular la disolución acumulativa, calcule la disolución de cada punto de tiempo (X_n):
      X_n = A / B x 100, donde A es la cantidad de componentes medida en cada punto de tiempo y B es el contenido teórico de cada componente.
   2. Luego, calcule la disolución acumulativa (Y):
      Y = X n + (X 1 + ... + X _n-1) x V 2 / V 1, donde V₁ es el volumen total del medio de disolución y V ₂ es el volumen de soluto agregado después de cada muestreo.
      NOTA: Debido a los bajos valores de respuesta de salidroside y ácido gálico en el cromatograma, la disolución acumulada de salidroside y galato de etilo en el punto de tiempo de 1 min no se trazó en la curva de disolución.

5. Ajuste del modelo de disolución

1. Importe los datos de disolución acumulativos en cada punto de tiempo en el software de análisis de datos.
2. Utilice el complemento de análisis de disolución de fármacos en el software de análisis de datos para ajustarse a la ecuación de GompertzMod, la ecuación de Gompertz, la ecuación logística y la ecuación de Weibull¹⁴. Cuanto mayor sea el valor de R², mejor será el efecto de ajuste de la curva.
   1. Inicie el software, seleccione la ventana Book1 para ingresar a la ventana Edición de datos de origen .
   2. En la primera columna A(X)-Tiempo de entrada de nombre largo, defina Tiempo como tiempo e ingrese cada tiempo de determinación de disolución. Datos de entrada en la segunda columna B(Y)-Nombre largo, defina Datos como la disolución acumulativa, introduzca el porcentaje de disolución acumulativa de cada tiempo de determinación de disolución.
   3. Después de la entrada de datos, seleccione la columna A (X) y B (Y), seleccione el complemento Análisis de disolución de medicamentos en la barra de menú del software y haga clic en Ajustar datos de disolución > Concatenar ajuste > Aceptar. El software genera los resultados de ajuste de cada modelo.

Resultados

En este estudio, la precisión, estabilidad, repetibilidad y recuperación de la muestra de RG estaban dentro del rango metodológico especificado en la Farmacopea China (Volumen 4, 2020)¹², lo que indica que el método era factible. Después de repetidas depuraciones, se determinó que el gradiente de elución utilizado en este estudio tenía buena resolución (Figura 1) para los tres componentes del índice en RG. Los tres componentes índice en RG tuvieron una buen...

Discusión

La prueba de disolución es un método in vitro ideal para simular la desintegración y disolución de preparaciones orales sólidas en el tracto gastrointestinal¹⁵. Es un índice importante para evaluar y controlar la calidad de las preparaciones orales sólidas. Por lo tanto, la prueba de disolución juega un papel esencial en el desarrollo de preparaciones orales de fármacos sólidos¹⁶. En particular, con el desarrollo de la tecnología de control de calidad de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS