Análisis e imagen de osteocitos

Resumen

Este estudio describe el método para visualizar y desarrollar modelos tridimensionales (3D) de osteocitos dentro de la red lacunar-canalicular (LCN) para el análisis de dinámica de fluidos computacional (CFD). Los modelos generados utilizando este método ayudan a comprender la mecanosensación de los osteocitos en huesos sanos o enfermos.

Resumen

Los osteocitos son las células óseas que se cree que responden a las tensiones mecánicas y al esfuerzo cortante del flujo de fluidos (FFSS) mediante la activación de varias vías biológicas en un proceso conocido como mecanotransducción. Los modelos confocales derivados de imágenes de redes de osteocitos son una herramienta valiosa para realizar análisis de dinámica de fluidos computacional (CFD) para evaluar las tensiones de cizallamiento en la membrana de los osteocitos, que no se pueden determinar mediante medición directa. El modelado computacional utilizando estas imágenes de alta resolución de la arquitectura microestructural del hueso se utilizó para simular numéricamente la carga mecánica ejercida sobre el hueso y comprender la estimulación inducida por la carga de los osteocitos.

Este estudio profundiza en los métodos para desarrollar modelos 3D de osteocitos individuales utilizando imágenes de microscopio confocal de la Red Lacunar-Canalicular (LCN) para realizar análisis CFD utilizando varios programas de modelado computacional. Antes de la microscopía confocal, los huesos de ratón se seccionan y se tiñen con un tinte de isotiocianato de fluoresceína (FITC) para marcar el LCN. Con una resolución de 100x, las imágenes de la pila Z se recogen utilizando un microscopio confocal y se importan al software MIMICS (software de procesamiento basado en imágenes 3D) para construir un modelo de superficie de los procesos LCN y osteocito-dendrítico.

A continuación, estas superficies se restan mediante una operación booleana en el software 3-Matic (software de optimización de datos 3D) para modelar el espacio fluídico lacunar alrededor del cuerpo de la célula del osteocito y el espacio canalicular alrededor de las dendritas que contienen líquido lacunocanalicular. La geometría volumétrica del fluido en 3D se importa al software ANSYS (software de simulación) para el análisis CFD. ANSYS CFX (software CFD) se utiliza para aplicar carga fisiológica en el hueso a medida que se presiona el fluido, y se determinan las tensiones de cizallamiento de la pared en los osteocitos y los procesos dendríticos. La morfología del LCN afecta a los valores de esfuerzo cortante detectados por la membrana celular del osteocito y los procesos celulares. Por lo tanto, los detalles de cómo se desarrollan los modelos confocales basados en imágenes pueden ser valiosos para comprender la mecanosensación de los osteocitos y pueden sentar las bases para futuros estudios en esta área.

Introducción

Se postula que los osteocitos regulan la masa ósea en respuesta al ejercicio físico¹. La deformación de la membrana de los osteocitos y sus procesos dendríticos debido a la carga mecánica, los somete a FFSS, que es detectada por los osteocitos y desencadena la señalización intracelular ^2,3,4. La microestructura ósea sufre deterioro o alteraciones en su morfología lacunar-canalicular debido al envejecimiento o a enfermedades óseas como la osteoporosis y la diabetes y en condiciones como la deficiencia de perlecan que provoca una alteración de la mecano-respuesta de los osteocitos ^5,6. Estos cambios en la arquitectura ósea hacen que los osteocitos experimenten diferentes niveles de FFSS y distensiones ^7,8. Es importante destacar que la FFSS experimentada por los osteocitos en respuesta a la carga mecánica es difícil de cuantificar in vivo porque están incrustados en la matriz ósea calcificada.

El modelado confocal basado en imágenes es una técnica poderosa para superar las limitaciones del estudio de osteocitos inaccesibles en su entorno natural mediante la replicación de modelos informáticos del LCN ^9,10. El procesamiento y modelado de la red interconectada de LCN en 3D ha sido un reto. Existen varias técnicas de imagen, como la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la microscopía electrónica de barrido (SEM), el seccionamiento de la cara del bloque en serie y la microscopía electrónica de barrido de haz de iones focalizada en serie (FIB/SEM)^2,11,12. Se desarrolló una valiosa técnica para visualizar el hueso 13,14,15 y generar modelos de osteocitos en 3D mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). CLSM fue elegido aquí para el modelado computacional en lugar de otras técnicas de imagen debido a su capacidad para obtener imágenes de todo el volumen de la laguna y la mayoría de los canalículos en 3D^16,17. La geometría LCN se puede generar utilizando CLSM para el análisis de elementos finitos (FEA) de osteocitos para predecir distensiones óseas. Sin embargo, el análisis de fluidos para predecir el FFSS experimentado por los osteocitos es más complicado, ya que requiere el modelado de la membrana celular del osteocito y sus dendritas dentro del LCN para permitir el modelado del estrecho espacio lacunar-canalicular, en el que el líquido intersticial se mueve alrededor de¹⁸.

En este protocolo, se aplica un tinte de isotiocianato de fluoresceína (FITC) a secciones gruesas de hueso no descalcificadas antes de la microscopía confocal para marcar el LCN dentro del hueso, y las membranas osteocito-dendríticas se modelan en función de los datos de imagen del LCN. El espacio lacunar-canalicular se simula mediante modelos computacionales, y la carga fisiológica debida a la actividad física se modela mediante un enfoque CFD. Los osteocitos se someten a un gradiente de presión de fluido en el software CFD para analizar el perfil de fluido dentro del LCN y medir FFSS en el osteocito y las membranas dendríticas. Además, un enfoque FEA puede medir las deformaciones o tensiones de los osteocitos mediante la aplicación de cargas mecánicas de compresión.

También se desarrolló una técnica de modificación de la geometría para modificar las microestructuras derivadas de imágenes de hueso joven y sano con el fin de simular la morfología lacunar-canalicular alterada en animales envejecidos o con enfermedad ósea. Las alteraciones de la microestructura ósea incluyeron la reducción del número de canalículos con el envejecimiento, la reducción del área del espacio lacunar-canalicular para modelar lo que sucede en la deficiencia de perlecan y su aumento para modelar los efectos del envejecimiento, y la reducción del área de la pared canalicular y dendrítica para modelar el hueso diabético ^5,6. La técnica de modificación de la geometría nos permite comparar las FFSS experimentadas por los osteocitos en hueso con diferentes microestructuras, como las jóvenes frente a las envejecidas o los huesos de animales sanos frente a los enfermos.

En general, el modelado confocal basado en imágenes es una herramienta valiosa para simular la morfología de los osteocitos en el hueso sano, así como en los cambios asociados al envejecimiento/enfermedad en la morfología de los osteocitos. Además, los parámetros morfológicos de los osteocitos, como el área de superficie y el volumen del espacio lacunar-canalicular, se pueden medir y comparar en varios huesos para predecir las respuestas celulares a la tensión mecánica.

Protocolo

Los experimentos con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri, Kansas City (UMKC), y se ajustaron a las pautas federales pertinentes.

1. Proceso de preparación del hueso

1. Recoja fémures de ratones hembra C57BL6 de 4 y 22 meses de edad y fíjelos en paraformaldehído frío al 4% en PBS durante 24 h a 4 °C con un balanceo suave, luego enjuáguelos en PBS y guárdelos en etanol al 70% antes de incrustarlos.
   NOTA: El volumen del fijador debe ser aproximadamente 20 veces el volumen del tejido
2. Incruste los huesos rápidamente en un acrílico de polimerización rápida (Tabla de Materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Es importante utilizar una resina de polimerización rápida para este paso (~10 min). El propósito es sostener el tejido óseo durante el corte con la sierra de diamante, pero sin que la resina penetre en el LCN, lo que bloquearía la penetración de la tinción FITC.
3. Corte cortes transversales gruesos de 300 μm de espesor de un sitio estandarizado por encima del tercer trocánter con una sierra de diamante y guárdelos a 4 °C en etanol al 70% antes de la tinción con FITC.
4. Pula las secciones con papel de lija de grano 600, 800 y luego 1200 hasta un grosor final de ~90-100 μm.
   NOTA: Se garantizó el logro del grosor adecuado utilizando un calibrador digital.
5. Enjuague las secciones con etanol al 70%, 95% y 100% durante 5 minutos cada una.
6. Teñirlos en 1% FITC en etanol al 100% durante 4 h a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad con agitación moderada.
7. Lave las secciones en etanol 100% durante 30 minutos agitando suavemente en la oscuridad. Luego, sécalos al aire durante la noche en la oscuridad.
8. Para montar, coloque la sección en una gota de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Utiliza pinzas para colocar la sección lo más plana posible contra el portaobjetos, evitando generar burbujas de aire y utilizando la resina circundante para manipular la muestra. Monta un cubreobjetos en la muestra.

2. Microscopía confocal

1. Utilice un microscopio confocal para obtener imágenes de los cortes de hueso teñidos con FITC.
2. Utilice un objetivo de aceite de 100x 1,44NA con un zoom digital de 1,7 y un tamaño de paso de 0,126 μm para recopilar pilas Z detalladas de 400 planos Z a 1024 x 1024 píxeles y una resolución de píxeles de 0,089 μm.
3. Utilice un láser de 488 nm para la excitación, con una ventana de recolección de emisiones de 496-596 nm. Recopile las pilas de imágenes utilizando la configuración de compensación para corregir la pérdida de señal con el aumento de la profundidad de la imagen.
4. Aumente la precisión y la resolución de las imágenes mediante el uso de técnicas de recopilación de imágenes, como el sobremuestreo y el aumento del promedio de líneas. Además, recoja las imágenes con un aumento de 5x, 20x y 100x de resolución de secciones transversales de secciones de fémur como se muestra en la Figura 1.
   NOTA: La imagen de baja resolución (5x) de la Figura 1 muestra el área completa de la sección transversal del fémur, con tres regiones seleccionadas para campos de imagen de 100x.
5. Utilice las pilas Z 100x para el modelado informático de osteocitos.

3. Modelado por ordenador

1. Importe las imágenes 100x recopiladas, en formato TIFF, al software ImageJ para crear una secuencia de imágenes del LCN en la dirección Z.
2. Importe las pilas Z en el software de procesamiento basado en imágenes 3D para construir una máscara del LCN después de definir la orientación de la imagen.
3. Umbral la imagen original de los ratones jóvenes y envejecidos entre 30.012-45.677 unidades de Hounsfield y 15.000-46.701 unidades de Hounsfield, respectivamente, para parecerse mucho al LCN. Ajuste el Umbral en el menú de sección para cambiar los límites de intensidad de píxeles para su inclusión en una máscara.
4. Recorte una laguna con sus canalículos como región de interés (ROI) de la pila mediante la operación Máscara de recorte . Defina el ROI de modo que rodee la laguna en el centro del cubo y todos sus canalículos conectados se extiendan a los lados del cubo. Encierra la laguna en un cubo imaginario más grande con longitudes de lado de 21 μm, 14 μm y 19 μm.
5. Dado que el modelo se crea a partir de varias partes, realice una operación de crecimiento de región para seleccionar las regiones de píxeles conectadas, eliminar el ruido y eliminar las manchas para generar un LCN uniforme.
6. Convierta la máscara lacunar-canalicular en un objeto mediante la operación Parte calculada en el software de procesamiento basado en imágenes 3D.
7. Construya el osteocito y las membranas dendríticas reduciendo el volumen de LCN mediante la operación de suavizado. Realice esta operación varias veces para lograr un espesor de espacio lacunar y canalicular de 0,75 μm y 0,08 μm, respectivamente ^9,18.
8. Exporte los objetos (formato STL) como último paso en el software de procesamiento basado en imágenes 3D.
9. Importe dos capas de las membranas LCN y osteocito-dendrítica en el software de optimización de datos 3D para generar una malla de volumen.
10. Utilice la herramienta Asistente de reparación en el software para identificar problemas de malla en cada pieza. Compruebe la calidad de la malla en la sección de diagnóstico del Asistente para reparaciones después de cada operación.
11. Elimine las partes normales invertidas, los triángulos que se intersecan y los contornos incorrectos mediante la operación de corrección automática del Asistente para corrección.
12. Reemplace los triángulos superpuestos manualmente definiendo otros nuevos o automáticamente a través de la operación Llenar agujero normal .
13. Mejore la calidad de la malla mediante operaciones que incluyen el filtrado de triángulos afilados, bordes pequeños y vaciados pequeños.
14. Después de mejorar la calidad de la malla, combine dos superficies de las membranas LCN y osteocito-dendrítica en una superficie (espacio fluídico lacunar-canalicular) que pertenezca a ambas partes utilizando un ensamblaje no múltiple.
15. Cree un modelo volumétrico del espacio lacunar-canalicular mediante la operación Remesh y, a continuación, expórtelo como un archivo STL. Ajuste la escala del objeto para que esté en micrómetros en la sección de exportación.

4. Técnica de modificación de geometría en el software de procesamiento basado en imágenes 3D y el software de optimización de datos 3D

NOTA: La técnica de modificación de geometría se utiliza para modelar cambios en la morfología de los osteocitos, como la densidad y el diámetro canalicular y el grosor lacunar-canalicular debido al envejecimiento o a la enfermedad ósea.

1. Elegir el osteocito joven como modelo base y modificarlo para construir otros modelos de osteocitos distintos mediante la aplicación de alteraciones morfológicas.
2. Genere un modelo de osteocitos con diferentes densidades canaliculares a partir del modelo base cambiando el umbral de la imagen en el software de procesamiento basado en imágenes 3D.
   1. Seleccione un umbral más bajo para reducir la intensidad de luz de la imagen y obtener una laguna con menos canalículos. La ventaja de la técnica de umbralización es que la forma y el tamaño de la laguna permanecen iguales, y solo se estudia la influencia de la densidad canalicular. En la Figura 2 se muestra el modelo envejecido simulado generado a partir del osteocito joven mediante la técnica de modificación de la geometría.
3. Desarrolle modelos de osteocitos con diferentes espesores de espacio lacunares-canaliculares o diámetros de dendrita/canalicular en el software de procesamiento basado en imágenes 3D y el software de optimización de datos 3D. Construya modelos de osteocitos más grandes o más pequeños mediante operaciones de envoltura o suavizado , respectivamente. La Figura 3 muestra seis modelos de osteocitos con geometría alterada desarrollados a partir del osteocito joven.

5. Análisis CFD

NOTA: Después de generar los modelos volumétricos de osteocitos, se llevan a cabo varios pasos, incluida la geometría, la malla y la configuración, en el módulo CFX del software de simulación.

1. Cree un flujo de fluido en el software de simulación para preparar los modelos para el análisis CFD.
2. Importe las geometrías confocales basadas en imágenes desarrolladas en la sección de geometría de CFX, conocida como ANSYS SpaceClaim (herramienta de modelado 3D). Establezca las dimensiones de la unidad en nanómetros en la configuración.
3. La geometría aparece como dos facetas de los procesos LCN y osteocito-dendrítico. Haga clic en Faceta en el menú superior y elimine los errores geométricos, como intersecciones, bordes afilados o sobreconectados y vértices, aberturas o agujeros para cada faceta.
4. Haga clic en Restar en el menú Faceta para reducir la faceta más pequeña y los procesos osteocito-dendríticos de la faceta más grande, el LCN, para lograr un solo cuerpo de espacio lacunar-canalicular. A continuación, haga clic con el botón derecho en la faceta generada y conviértala de facetas a un dominio sólido sin fusionar caras. La figura 4 muestra el área de la sección transversal del modelo de osteocito joven, que representa el espacio lacunar-canalicular.
5. Haga clic en malla y seleccione elementos tetraédricos lineales con un tamaño de elemento de 0,06 μm. Refinar la malla con un estudio de convergencia de malla para tener suficientes elementos en el diminuto sistema dendrítico para garantizar que los resultados sean independientes del tamaño de la malla.
6. Seleccione la superficie y elija los canalículos en la parte superior del cubo imaginario como entradas de fluido. Seleccione los canalículos en las otras cinco caras como salidas de fluido usando Box select.
7. Exporte la malla (formato de archivo fluido) a medida que se carga más rápido en la configuración en el siguiente paso.
8. Cree otro flujo de fluido en el software de simulación e importe la malla fluida en la sección de configuración de CFX. Defina dos condiciones de contorno de sumideros y salidas para las caras preseleccionadas como sumideros/desagües mediante la opción Insertar contorno .
9. Para imitar las condiciones fisiológicas, ejerza una presión de entrada de fluido de 300 Pa y 0 Pa en las entradas y salidas, respectivamente ^19,20. Trate las superficies restantes como paredes con una condición antideslizante en ese fluido que tiene velocidad cero en la interfaz de las paredes. El líquido fluye desde las entradas alrededor de las dendritas y el cuerpo de las células osteocitarias y sale de los otros canalículos asignados como salidas.
10. Tratar el líquido laminar intersticial como agua⁹, elegida de la biblioteca de materiales. Establezca las secciones Transferencia de calor, Combustión y Radiación térmica en Ninguno, ya que no hay transferencia de calor definida en el problema. Seleccione el modo de turbulencia como la característica del fluido en el LCN, que es un fluido laminar⁹.
11. Ejecute el software utilizando Doble precisión e Inicio directo como tipo de envío. Controle la masa y el momento hasta que los residuos caigan y se vuelvan constantes. Después de la convergencia de la solución, mida los datos de FFSS utilizando la sección CFD-post del software CFD.

6. Posprocesamiento de CFD

1. Para representar el FFSS experimentado por los osteocitos y sus dendritas, inserte un nuevo contorno en la sección de resultados del software CFD. Cree un contorno FFSS eligiendo el cizallamiento de la pared en las membranas osteocito-dendríticas como variable en el dominio.
   NOTA: Para mostrar mejor los FFSS altos en las membranas dendríticas, el rango de FFSS se establece en Especificado por el usuario para modificar los valores mínimos/máximos de FFSS.
2. Inserte un contorno de líneas de corriente de velocidad dentro del dominio lacuna-canalicular a partir de las entradas. Establezca el muestreo en el mismo espaciado y seleccione el número de puntos como 2500. Una sección de animación en el software CFD muestra con precisión en 3D cómo fluyen las partículas de fluido dentro de los espacios lacunares-canaliculares utilizando el gráfico de velocidad de la corriente.
3. Utilice la herramienta Calculadora de funciones en el software CFD para analizar la magnitud de FFSS o la velocidad en función de parámetros geométricos, especialmente cuando hay varios modelos de osteocitos (es decir, jóvenes vs. viejos). Mida el volumen y el área superficial del espacio lacunar-canalicular como parámetros geométricos junto con los valores máximos, mínimos o promedio de FFSS.

Resultados

Este protocolo describe cómo desarrollar modelos de osteocitos derivados de confocales para investigar la cantidad de esfuerzo cortante del flujo de fluido a la que están sometidos un osteocito y sus procesos dendríticos debido a la carga mecánica. Se seleccionó un ratón C57BL6 envejecido y otro joven para construir modelos de osteocitos basados en imágenes confocales jóvenes y envejecidos. Se generaron otros seis modelos de osteocitos simulados a partir del mismo modelo de osteo...

Discusión

Este protocolo describe una técnica de imagen confocal para la visualización y el modelado computacional de los osteocitos. Antes de la obtención de imágenes confocal, se realiza el proceso de preparación ósea para seccionar y teñir muestras óseas. Las imágenes confocales de aumento de 100x se importan a varios programas informáticos para desarrollar modelos informáticos de osteocitos y el espacio lacunar-canalicular. Por último, se lleva a cabo un análisis CFD en los modelo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,200 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic software	Materialise	https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic	3D data optimization software
600 grit sandpaper	Buehler	30-5118-600-100
800 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS software	ANSYS	https://www.ansys.com/	simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ software		https://imagej.net/ij/
Immersion Oil for Microscopes	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 inner hole diamond saw	Leica
MIMICS Innovation Suite software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	3D image-based processing software
Permount mount medium	Fisher scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Reliable scientific INC	Model 55S