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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo investiga los efectos protectores de la platycodin D sobre la enfermedad del hígado graso no alcohólico en un modelo in vitro inducido por ácido palmítico.

Resumen

La incidencia de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) ha aumentado a un ritmo alarmante en todo el mundo. Platycodon grandiflorum es ampliamente utilizado como etnomedicina tradicional para el tratamiento de diversas enfermedades y es un alimento funcional típico que se puede incorporar a la dieta diaria. Los estudios han sugerido que la platycodin D (PD), uno de los principales ingredientes activos de Platycodon grandiflorum, tiene una alta biodisponibilidad y mitiga significativamente el progreso de NAFLD, pero el mecanismo subyacente de esto aún no está claro. Este estudio tiene como objetivo investigar el efecto terapéutico de la EP contra la EHGNA in vitro. Las células de AML-12 se trataron previamente con ácido palmítico (PA) de 300 μM durante 24 h para modelar NAFLD in vitro. Luego, las células fueron tratadas con EP o no recibieron tratamiento con EP durante 24 h. Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) se analizaron mediante tinción de diacetato de 2′,7′-dicloro-dihidrofluoresceína (DCFH-DA), y el potencial de membrana mitocondrial se determinó mediante el método de tinción JC-1. Además, los niveles de expresión proteica de LC3-II/LC3-I y p62/SQSTM1 en los lisados celulares se analizaron mediante western blotting. Se encontró que la EP disminuye significativamente los niveles de ROS y potencial de membrana mitocondrial en el grupo tratado con PA en comparación con el grupo control. Mientras tanto, la DP aumentó los niveles de LC3-II/LC3-I y disminuyó los niveles de p62/SQSTM1 en el grupo tratado con PA en comparación con el grupo control. Los resultados indicaron que la EP mejoró la NAFLD in vitro al reducir el estrés oxidativo y estimular la autofagia. Este modelo in vitro es una herramienta útil para estudiar el papel de la EP en la EHGNA.

Introducción

Platycodon grandiflorus (PG), que es la raíz seca de Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., se utiliza en la medicina tradicional china (MTC). Se produce principalmente en las regiones noreste, norte, este, centro y suroeste de China1. Los componentes PG incluyen saponinas triterpenoides, polisacáridos, flavonoides, polifenoles, polietilenglicoles, aceites volátiles y minerales2. PG tiene una larga historia de ser utilizado como un alimento y una medicina herbal en Asia. Tradicionalmente, esta hierba se usaba para hacer medicamentos contra las enfermedades pulmonares. La farmacología moderna también proporciona evidencia de la eficacia de PG para tratar otras enfermedades. Los estudios han demostrado que PG tiene un efecto terapéutico en una variedad de modelos de lesión hepática inducida por fármacos. La suplementación dietética de extractos de PG o platycodin puede mejorar la obesidad inducida por la dieta alta en grasas y sus enfermedades metabólicas relacionadas 3,4,5. Los polisacáridos de PG se pueden utilizar para el tratamiento de la lesión hepática aguda causada por LPS / D-GalN en ratones6. Además, las saponinas de las raíces de PG mejoran la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta alta en grasas (EHNA)7. Además, la platycodin D (PD), uno de los componentes terapéuticos más importantes de PG, puede mejorar la expresión del receptor de lipoproteínas de baja densidad y la captación de lipoproteínas de baja densidad en células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2)8. Además, la EP también puede inducir apoptosis e inhibir la adhesión, migración e invasión en las células HepG2 9,10. Por lo tanto, en este estudio, las células de ratón de hepatoma AML-12 se utilizan para la construcción de modelos in vitro y para estudiar más a fondo los efectos farmacológicos y los mecanismos subyacentes de la EP en este modelo.

El término enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) se refiere a un grupo de enfermedades hepáticas que incluye esteatosis simple, NASH, cirrosis y carcinoma hepatocelular11. Aunque la patogénesis de NAFLD no se comprende completamente, desde la teoría clásica de "dos golpes" hasta la teoría actual de "múltiples golpes", la resistencia a la insulina se considera central en la patogénesis de NAFLD12,13,14. Los estudios han demostrado que la resistencia a la insulina en los hepatocitos podría conducir a un aumento de los ácidos grasos libres, que forman triglicéridos que se depositan en el hígado y hacen que el hígado se vuelva graso15,16. La acumulación de grasa puede conducir a lipotoxicidad, disfunción mitocondrial inducida por estrés oxidativo, estrés del retículo endoplásmico y liberación de citoquinas inflamatorias, lo que resulta en la patogénesis y progresión de NAFLD17,18. Además, la autofagia también juega un papel en la patogénesis de NAFLD, ya que está involucrada en la regulación de la sensibilidad celular a la insulina, el metabolismo lipídico celular, la lesión de hepatocitos y la inmunidad innata 19,20,21.

Se han establecido una variedad de modelos animales y modelos celulares para proporcionar una base para explorar la patogénesis y los posibles objetivos terapéuticos de NAFLD22,23. Sin embargo, los modelos de un solo animal no pueden imitar completamente todos los procesos patológicos de NAFLD24. Las diferencias individuales entre los animales conducen a diferentes características patológicas. El uso de líneas celulares hepáticas o hepatocitos primarios en estudios in vitro de NAFLD garantiza la máxima consistencia en las condiciones experimentales. La desregulación del metabolismo lipídico hepático puede conducir a niveles más altos de acumulación de gotitas lipídicas de hepatocitos en NAFLD25. Los ácidos grasos libres como el ácido oleico y el aceite de palma han sido utilizados en el modelo in vitro para imitar la EHGNA causada por una dieta alta en grasas26,27. La línea celular de hepatoblastoma humano HepG2 se utiliza a menudo en la construcción de modelos de NAFLD in vitro, pero, como línea celular tumoral, el metabolismo de las células HepG2 es significativamente diferente del de las células hepáticas en condiciones fisiológicas normales28. Por lo tanto, el uso de hepatocitos primarios o hepatocitos primarios de ratón para construir el modelo in vitro de NAFLD para la detección de fármacos es más ventajoso que el uso de líneas celulares tumorales. Al comparar el examen sinérgico de los efectos de los fármacos y las dianas terapéuticas tanto en modelos animales como en modelos de hepatocitos in vitro, parece que el uso de hepatocitos de ratón para construir el modelo de hígado graso no alcohólico in vitro tiene un mejor potencial de aplicación.

Los ácidos grasos libres que entran en el hígado se oxidan para producir energía o se almacenan como triglicéridos. Significativamente, los ácidos grasos libres tienen cierta lipotoxicidad y pueden inducir disfunción celular y apoptosis12. El ácido palmítico (AP) es el ácido graso saturado más abundante en el plasma humano29. Cuando las células en el tejido no adiposo están expuestas a altas concentraciones de PA durante mucho tiempo, esto estimula la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y causa estrés oxidativo, acumulación de lípidos e incluso apoptosis30. Por lo tanto, muchos investigadores utilizan PA como inductor para estimular las células hepáticas para producir ROS y, así, construir el modelo de enfermedad del hígado graso in vitro y evaluar los efectos protectores de ciertas sustancias activas en las células31,32,33,34. Este estudio introduce un protocolo para investigar los efectos protectores de la EP en un modelo celular de NAFLD inducida por PA.

Protocolo

Las células AML-12 (una línea celular normal de hepatocitos de ratón) se utilizan para los estudios basados en células. Las células se obtienen de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).

1. Pretratamiento de las células AML-12 para modelar NAFLD in vitro

  1. Mantener las células en medios de cultivo celular normales (DMEM más F12 [1:1] de Ham que contiene 0,005 mg/ml de insulina, 5 ng/ml de selenio, 0,005 mg/ml de transferrina, 40 ng/ml de dexametasona y 10% de suero fetal bovino [FBS], ver Tabla de materiales) a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% deCO2.
  2. Sembrar las células en placas de 12 pocillos (1 mL/pocillo) con una densidad de 2,8 x 105 células/pocillo.
    NOTA: Todas las operaciones de digestión celular e intercambio de medios se realizan en un gabinete de bioseguridad para evitar contaminar las células.
  3. Retire el medio de cultivo de las células después de la incubación durante la noche (~ 10 h) y luego lave las células dos veces con 1 ml de medios sin suero (por pocillo).
  4. Divida la placa celular de 12 pocillos en cuatro grupos de tratamiento diferentes de izquierda a derecha, incluyendo (1) el grupo de control, (2) el grupo tratado con EP, (3) el grupo tratado con PA y (4) el grupo tratado con PA + PD.
    NOTA: Tres réplicas de cada grupo de tratamiento experimental están dispuestas de arriba a abajo en la misma placa celular de 12 pocillos.
  5. Agregue los medios de cultivo celular normales (1 ml/pocillo) al grupo control y al grupo tratado con DP, y agregue los medios de cultivo celular normales (1 ml/pocillo) suplementados con 300 μM de PA al grupo tratado con PA y PA + PD.
  6. Retire el medio de cultivo de las células después de 24 h de incubación y luego lave las células con 1 ml de medio sin suero (por pocillo) dos veces.
  7. Añadir medios de cultivo celular normales (1 ml/pocillo) suplementados con un vehículo (dimetilsulfóxido, DMSO, 0,1% v/v) al grupo control; añadir medios de cultivo celular normales (1 ml/pocillo) suplementados con 1 μM de DP al grupo tratado con DP; agregar medios de cultivo celular normales (1 ml/pocillo) suplementados con 300 μM PA al grupo tratado con PA; añadir medios de cultivo celular normales (1 ml/pocillo) suplementados con 300 μM PA y 1 μM PD al grupo tratado con PA + DP.
  8. Después de la incubación durante 24 h adicionales, investigue los efectos protectores de la EP en las células utilizando tinción con diacetato de 2′,7′-dicloro-dihidrofluoresceína (DCFH-DA) (paso 2), tinción JC-1 (paso 3) y Western blot (paso 4).
    NOTA: Todas las operaciones de incubación se realizan a 37 °C en atmósfera humidificada con un 5% deCO2.

2. Medición del cambio en la producción de ROS

NOTA: Los niveles de ROS intracelular en las células se evalúan en función del ensayo de tinción DCFH-DA.

  1. Al final del período de tratamiento (paso 1.8), lave las células con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato por pocillo (1x PBS, pH 7.4) tres veces, y luego tiñe las células con 100 μL de 10 μM DCFH-DA por pocillo (ver Tabla de materiales). Incubar las células en la oscuridad durante 30 minutos.
    NOTA: Si no se observa fluorescencia verde obvia después de 30 minutos de incubación, el tiempo de incubación de la sonda y las células se puede aumentar adecuadamente (30-60 min). Si se observa una sobreexposición del valor de fluorescencia verde después de 30 minutos de incubación, el tiempo de incubación de la sonda y las células puede reducirse adecuadamente (15-30 min).
  2. Lave las células con 1x PBS (1 ml/pocillo) tres veces. Agregue 1 ml de 1x PBS a cada pocillo.
  3. Coloque la placa de 12 pocillos en la etapa del microscopio (consulte la Tabla de materiales) y luego use un objetivo de 20x para observar la morfología de las células (aumento: 200x).
  4. Capture tres imágenes de fluorescencia representativas (aumento: 200x) para cada pocillo en el microscopio de fluorescencia utilizando el canal fluorescente verde con una longitud de onda de excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.
    NOTA: Se recomienda el canal fluorescente verde con una longitud de onda de excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm para detectar el DCFH-DA. Además, DCFH-DA se puede detectar con los ajustes de parámetros para GFP y FITC en el microscopio de fluorescencia35,36.
  5. Finalmente, procese las imágenes con software de adquisición de imágenes (consulte la Tabla de materiales) y luego use el software ImageJ para calcular la intensidad media de fluorescencia de cada grupo o las proporciones de los diferentes grupos.
    NOTA: Los detalles técnicos del microscopio de fluorescencia y del software Image J utilizados para el trabajo de imagen se han descrito previamente37,38.

3. Medición del cambio en el potencial de la membrana mitocondrial

NOTA: Los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial se monitorean mediante el ensayo de tinción JC-1.

  1. Al final del período de tratamiento (paso 1.8), lavar las células con 1 ml de 1x PBS por pocillo tres veces, y luego teñir las células con 100 μL de solución de trabajo JC-1 de 5 μg/ml (ver Tabla de materiales) durante 30 min a 37 °C en la oscuridad.
    NOTA: Si no se observa fluorescencia verde obvia después de 30 minutos de incubación, el tiempo de incubación de la sonda y las células se puede aumentar adecuadamente (30-60 min). Si se observa una sobreexposición del valor de fluorescencia verde después de 30 minutos de incubación, el tiempo de incubación de la sonda y las células puede reducirse adecuadamente (15-30 min).
  2. Lave las células con 1x PBS (1 ml/pocillo) tres veces. Agregue 1 ml de 1x PBS a cada pocillo.
  3. Coloque la placa de 12 pocillos en la etapa de microscopio y luego use un objetivo de 20x para observar la morfología de las células (aumento: 200x).
  4. Capture tres imágenes de fluorescencia representativas (aumento: 200x) para cada pocillo en el microscopio de fluorescencia utilizando el canal fluorescente verde con longitudes de onda de excitación y emisión de 485 nm y 535 nm, respectivamente, y el canal fluorescente rojo con longitudes de onda de excitación y emisión de 550 nm y 600 nm, respectivamente.
    NOTA: El canal fluorescente verde con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm se utiliza para detectar el monómero JC-1, que se trata como mitocondrias despolarizadas 39,40,41, y el canal fluorescente rojo con una longitud de onda de excitación de 550 nm y una longitud de onda de emisión de 600 nm se utiliza para detectar el dímero JC-1, que se trata como mitocondrias polarizadas 39,40,41.
  5. Finalmente, procese las imágenes con software de adquisición de imágenes y luego use el software Image J para calcular la intensidad media de fluorescencia de cada grupo o las proporciones de los diferentes grupos.
    NOTA: Los detalles técnicos del microscopio de fluorescencia y del software Image J utilizados para el trabajo de imagen se han descrito previamente37,38.

4. Medición de los niveles de expresión proteica de LC3-II/LC3-I y p62/SQSTM1

  1. Después del tratamiento (paso 1.8), lavar las células tres veces con 1x PBS (1 ml/pocillo) que se haya enfriado previamente a 4 °C.
  2. Agregue el tampón de lisis RIPA (100 μL/pocillo) suplementado con proteasa y un cóctel inhibidor de la fosfatasa (1x) (ver Tabla de materiales) a la placa de 12 pocillos, y lisar en hielo durante 5 min.
  3. Recoger el lisado celular en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 12.000 x g durante 20 min a 4 °C. Determinar la concentración proteica de los sobrenadantes por el método BCA siguiendo los procedimientos estándar42.
  4. Agregue el búfer de carga de muestras SDS-PAGE (5x, consulte la Tabla de materiales) a los sobrenadantes de lisado celular (relación de volumen = 1: 4).
  5. Mezclar por vórtice (a alta velocidad durante ~15 s), y calentar las muestras mezcladas a 100 °C durante 5 min para desnaturalizar la proteína.
  6. Coloque el gel SDS-PAGE al 12% bien preparado en el tanque de electroforesis y luego agregue el tampón de muestra ascendente SDS (1x) diluido con agua ultrapura a la posición límite de altura.
    NOTA: El gel SDS-PAGE se prepara utilizando un kit comercial (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  7. Añadir el marcador proteico (5 μL/pocillo) y las muestras (20 μg/pocillo) en diferentes pocillos del gel SDS-PAGE.
  8. Ajuste el modo de voltaje estable a 100 V y realice la electroforesis durante 80 min.
  9. Después de la electroforesis SDS-PAGE, llevar a cabo la electrotransferencia de las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (0,45 μM, ver Tabla de materiales) siguiendo los informes publicados previamente43,44.
  10. Después de la electrotransferencia de las proteínas, lavar la membrana de PVDF con 10 ml de TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) dos veces (5 min/tiempo) en un agitador a temperatura ambiente.
  11. Bloquear la membrana de PVDF con 5 ml de albúmina sérica bovina (BSA, 5%) en un agitador a temperatura ambiente durante 1 h.
  12. Lave la membrana de PVDF con 10 ml de TBST tres veces (10 min/tiempo). Luego, incubar la membrana de PVDF en 5 ml de los anticuerpos primarios específicos diluidos en tampón de bloqueo para LC3 (mAb de ratón, 1:2,000), p62/SQSTM1 (en adelante, p62, mAb de ratón, 1:2,000) y β-actina (mAb de ratón, 1:2,000) (ver Tabla de materiales) durante la noche a 4 °C.
  13. Lave la membrana de PVDF con 10 ml de TBST tres veces (10 min/tiempo) a temperatura ambiente. Luego, incubar la membrana de PVDF con el anticuerpo secundario IgG (HRP) anti-ratón de conejo diluido en tampón de bloqueo (1:10,000) (ver Tabla de materiales) a temperatura ambiente y protegido de la luz durante 2 h.
  14. Lave la membrana de PVDF con 10 ml de TBST tres veces (10 min/tiempo) a temperatura ambiente. Luego, coloque la membrana de PVDF en la envoltura de plástico, agregue una cantidad adecuada de solución de trabajo ECL (200 μL / membrana) (consulte la Tabla de materiales) e incube durante 2 minutos.
  15. Después de la incubación, retire la solución de trabajo ECL y exponga la membrana de PVDF en el sistema de imágenes para el desarrollo de imágenes. Finalmente, use el software Image J para analizar los valores de gris de cada banda.
    NOTA: Los detalles técnicos del software Western Blotting e Image J utilizados para el trabajo de imagen se han descrito previamente45,46.

5. Análisis estadístico

  1. Presente los datos de los experimentos como la media ± la desviación estándar (DE).
  2. Realizar el análisis de significancia con la herramienta de software estadístico descrita anteriormente47.
  3. Calcule las diferencias estadísticas entre los dos grupos utilizando una prueba t. Un valor de p por debajo de 0,05 se considera estadísticamente significativo: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Resultados

ROS intracelular en las células
Se indujeron células AML-12 con 300 μM PA durante 24 h, y se estableció un modelo de células NAFLD. Posteriormente, las células fueron tratadas con DP durante 24 h. Las células se marcaron con una sonda fluorescente DCFH-DA, y la producción de ROS se observó bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados de la tinción DCFH-DA de ROS intracelulares en las células se muestran en la Figura 1. Los resultados mostraron que la EP...

Discusión

Estudios han destacado el hecho de que NAFLD es un síndrome clínico-patológico, que va desde el hígado graso hasta NASH, que puede progresar a cirrosis y cáncer de hígado51. Una dieta alta en grasas y un estilo de vida inactivo son factores de riesgo típicos para NAFLD. Tanto las terapias no farmacológicas como las terapias farmacológicas para el tratamiento de NAFLD se han investigado51,52,53. S...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de la Comisión de Ciencia y Tecnología de Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 y jbky20210029) y la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (No. 2021MD703919).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
5% BSA Blocking BufferSolarbio, Beijing, ChinaSW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell lineProcell Life Science&Technology Co., Ltd, ChinaAML12
Beyo ECL PlusBeyotime, Shanghai, ChinaP0018S
Bio-safety cabinetEsco Micro Pte Ltd, SingaporeAC2-5S1 A2 
cellSensOlympus, Tokyo, Japan1.8
Culture CO2 IncubatorEsco Micro Pte Ltd, SingaporeCCL-170B-8
DexamethasoneBeyotime, Shanghai, ChinaST125
Dimethyl sulfoxideSolarbio, Beijing, ChinaD8371
DMEM/F12Hyclone, Logan, UT, USASH30023.01
Foetal Bovine SerumHyclone, Tauranga, New ZealandSH30406.05
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)ABclonal, Wuhan, ChinaAS003
Hydrophobic PVDF Transfer MembraneMerck, Darmstadt, GermanyIPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×Beyotime, Shanghai, ChinaC0341
MAP LC3β AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1Solarbio, Beijing, ChinaM8650
Olympus Inverted Microscope IX53Olympus, Tokyo, JapanIX53
Palmitic AcidSigma, GermanyP0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)Hyclone, Logan, UT, USASV30010
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotime, Shanghai, ChinaST506
Phosphate Buffered SolutionHyclone, Logan, UT, USABL302A
Platycodin DChengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, ChinaCSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100xBeyotime, Shanghai, ChinaP1005
Protein MarkerSolarbio, Beijing, ChinaPR1910
Reactive Oxygen Species Assay KitSolarbio, Beijing, ChinaCA1410
RIPA Lysis BufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotime, Shanghai, ChinaP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xBeyotime, Shanghai, ChinaP0015
Sigma CentrifugeSigma, Germany3K15
SQSTM1/p62 AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-28359
Tecan Infinite 200 PRO  Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
WB Transfer Buffer,10xSolarbio, Beijing, ChinaD1060
β-Actin Mouse mAbABclonal, Wuhan, ChinaAC004

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