Aislamiento y purificación de células endoteliales microvasculares y macrovasculares a partir de muestras derivadas de pulmón

Resumen

Aunque es un desafío, el aislamiento de las células endoteliales pulmonares es esencial para los estudios sobre la inflamación pulmonar. El presente protocolo describe un procedimiento para el aislamiento de alto rendimiento y alta pureza de células endoteliales macrovasculares y microvasculares.

Resumen

La disponibilidad de células aisladas de tejidos y órganos sanos y enfermos representa un elemento clave para los enfoques de medicina personalizada. Aunque los biobancos pueden proporcionar una amplia colección de células primarias e inmortalizadas para la investigación biomédica, estos no cubren todas las necesidades experimentales, particularmente las relacionadas con enfermedades o genotipos específicos. Las células endoteliales vasculares (CE) son componentes clave de la reacción inflamatoria inmune y, por lo tanto, desempeñan un papel central en la patogénesis de una variedad de trastornos. En particular, las CE de diferentes sitios muestran diferentes propiedades bioquímicas y funcionales, lo que hace que la disponibilidad de tipos específicos de EC (es decir, macrovascular, microvascular, arterial y venosa) sea esencial para diseñar experimentos confiables. Aquí, se ilustran en detalle procedimientos simples para obtener células endoteliales macrovasculares y microvasculares humanas de alto rendimiento, prácticamente puras, a partir de la arteria pulmonar y el parénquima pulmonar. Esta metodología puede ser fácilmente reproducida a un costo relativamente bajo por cualquier laboratorio para lograr la independencia de las fuentes comerciales y obtener fenotipos/genotipos EC que aún no están disponibles.

Introducción

El endotelio vascular recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos. Desempeña un papel clave en la regulación de la coagulación sanguínea, el tono vascular y las respuestas inmunoinflamatorias 1,2,3,4. Aunque el cultivo de células endoteliales (CE) aisladas de especímenes humanos es esencial para fines de investigación, debe señalarse que las CE de diferentes vasos sanguíneos (arterias, venas, capilares) tienen funciones específicas. Estos no pueden ser completamente recapitulados por las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), que son fácilmente disponibles y ampliamente utilizadas en estudios sobre fisiopatología del endotelio vascular ^5,6. Por ejemplo, las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) desempeñan un papel clave en la inflamación pulmonar al controlar el reclutamiento y la acumulación de leucocitos ^4,7. Por lo tanto, un entorno experimental dirigido a reproducir la inflamación pulmonar con alta fidelidad debe incluir HLMVEC. Por otro lado, la disfunción EC se puede observar en varias patologías; por lo tanto, las CE del paciente son fundamentales para construir un modelo in vitro confiable de la enfermedad. Por ejemplo, el aislamiento de fragmentos de CE de la arteria pulmonar (HPAECs), diseccionados de los pulmones explantados de personas afectadas por fibrosis quística (FQ), nos ha permitido descubrir mecanismos de disfunción endotelial en esta enfermedad ^8,9.

Por lo tanto, los protocolos destinados a optimizar el aislamiento de CE de diferentes fuentes / órganos también en estados de enfermedad son esenciales para proporcionar a los investigadores herramientas de investigación valiosas, particularmente cuando estas herramientas no están disponibles comercialmente. Los protocolos de aislamiento HLMVEC y HPAEC han sido reportados previamente 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. En todos los casos, la digestión enzimática de las muestras pulmonares dio lugar a poblaciones de células mixtas, que se purificaron utilizando medios selectivos ad hoc y perlas magnéticas o clasificación celular basada en citometría. Las optimizaciones adicionales de estos protocolos deben abordar dos problemas principales en el aislamiento de CE: (1) contaminación celular y tisular, que debe resolverse lo antes posible en los pasajes de cultivo para minimizar la senescencia replicativa EC²⁰; y 2) el bajo rendimiento de las cepas primarias de CE.

Este estudio describe un nuevo protocolo para el aislamiento de alto rendimiento y alta pureza de HLMVEC y HPAEC. Este procedimiento puede ser fácilmente aplicable y proporcionar CE macrovasculares y microvasculares prácticamente puras en unos pocos pasos.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado y el protocolo siguió las directrices del comité de ética en investigación humana de la Universidad de Chieti-Pescara (#237_2018bis). La Figura 1 ilustra el aislamiento de células endoteliales de segmentos (1-3 cm de largo) de parénquima pulmonar o arteria pulmonar de sujetos humanos no identificados (con consentimiento escrito) sometidos a cirugía torácica por diversas razones, como neumotórax o lobectomía. En este último caso, los cirujanos también recolectaron un segmento de la arteria pulmonar. En particular, los cirujanos recibieron instrucciones precisas para recolectar muestras libres de cáncer. El protocolo presentado fue optimizado para obtener el mayor rendimiento y pureza posibles.

1. Preparación experimental

1. Reconstitución de colagenasa
   1. Disuelva el polvo de colagenasa en solución salina tamponada con fosfato sin CaCl 2 y MgCl 2 (PBS⁻⁻, ver Tabla de materiales) a una concentración de₂ mg/ml, y filtre la solución usando un filtro de poros de 0,22 μm.
   2. Preparar 5 ml de alícuotas y almacenarlas a −20 °C. Descongelar y precalentar las alícuotas a 37 °C antes de su uso.
2. Revestimiento de placas
   1. Para el recubrimiento de la placa, pipetear una solución de gelatina al 1,5% o 50 μg/ml de fibronectina (ver Tabla de materiales) en la placa de cultivo (500 μL es suficiente para cubrir la superficie de cada pocillo de una placa de 6 pocillos) e incubar durante 1 h a 37 °C.
   2. Después de la incubación, retire el exceso de gelatina y lave los pocillos con PBS−⁻. Aspire el PBS−^−, y deje que la placa se seque en una campana estéril.
      NOTA: Para la reconstitución de la gelatina, disolver el polvo en agua para hacer una solución al 1,5%, luego autoclave, y almacenar a 4 °C. La gelatina al 1,5% no es líquida a 4 °C; Por lo tanto, debe calentarse antes del recubrimiento de la placa. Alternativamente, cualquier solución de gelatina comercial adecuada para cultivos celulares se puede utilizar para el recubrimiento de placas.

2. Preparación de la muestra

1. Parénquima pulmonar
   1. Lave las muestras recolectadas sumergiéndolas en un tubo de 50 ml que contenga PBS−⁻.
   2. Transfiera las muestras a una placa de Petri estéril y corte manualmente la muestra con tijeras quirúrgicas (tamaño óptimo: >2 cm) en pequeños fragmentos de aproximadamente 3-4 mm cada uno.
2. Segmento(s) arterial(es)
   1. Lave las muestras recolectadas sumergiéndolas en un tubo de 50 ml que contenga PBS−⁻.
   2. Transfiéralo a una placa de Petri estéril sin cortar, ya que la fragmentación aumentará el área de superficie de la sección transversal del segmento arterial, aumentando así la posibilidad de aislar los no CE.

3. Digestión enzimática

1. Lave el parénquima pulmonar cortado en cubitos o el segmento o segmentos de la arteria pulmonar dos veces con PBS⁻⁻. Este paso eliminará una gran parte de la sangre residual.
2. Colocar las muestras en tubos de 15 ml e incubar con 5 ml de colagenasa tipo 2 (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C y 5% de_CO2. Durante esta incubación, la degradación de la matriz extracelular libera células individuales y agregados celulares.

4. Recuperación de las células digeridas

1. Coloque un colador estéril de acero/metal (es decir, un colador de té con un tamaño de malla de ~ 1 mm) en la parte superior de un tubo de recolección de 50 ml.
2. Vierta todo el contenido del tubo de 15 ml en el colador, masajee suavemente el tejido digerido con una espátula y enjuague la muestra con PBS⁻⁻ hasta que se llene el tubo de recolección.
   NOTA: Este paso eliminará grandes fragmentos de tejido en la escala milimétrica, asegurando una mayor eficiencia de los pasos de filtración posteriores.

5. Eliminación no EC por filtración

1. Filtrar el flujo de salida recogido en el paso 4.2 utilizando un filtro celular con un tamaño de malla de 70 μm y recoger el flujo de salida en un tubo fresco de 50 ml.
2. Luego, use un filtro celular con un tamaño de malla de 40 μm y recoja el flujo de salida en un tubo fresco de 50 ml. Etiquete este tubo como "tubo 1".
   NOTA: Estas filtraciones de los pasos 5.1 y 5.2 eliminarán los agregados de células grandes, que a menudo están compuestos por poblaciones de células mixtas.

6. Sedimentación de grupos celulares y siembra celular

1. Centrifugar las muestras a 30 x g durante 5 min a temperatura ambiente para sedimentar los grupos de células.
2. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta estéril (no lo vierta) y colóquelo en un tubo fresco de 50 ml ("tubo 2").
3. Suspenda el pellet en el "tubo 1" y llene el tubo hasta 50 ml con PBS−⁻. Llene el "tubo 2" hasta 50 ml con PBS−^−.
   NOTA: A partir de este paso, ambos tubos se tratan de la misma manera.
4. Centrifugar las muestras a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Suspender los gránulos con 2 ml de medio de cultivo (ver Tabla de materiales) y sembrar la suspensión en dos pocillos separados de una placa prerecubierta de 6 pocillos (paso 1.2).
   NOTA: A partir de este paso, alimentar las células cada 2 días con el medio de cultivo hasta que alcancen la confluencia (aproximadamente 1 semana, dependiendo del tamaño de la muestra) con el fin de obtener un número razonable de células para la clasificación.

7. Expansión celular

1. Lave las células con 2 ml de PBS con CaCl 2 y MgCl₂ (PBS++, ver Tabla de materiales) para eliminar las células sanguíneas residuales (el uso de PBS⁺⁺ es importante para evitar el desprendimiento celular).
2. Elimine el PBS⁺⁺ y agregue un medio de cultivo fresco.
3. Repita los pasos 7.1 y 7.2 hasta que las células alcancen la confluencia (aproximadamente 1 semana, dependiendo del tamaño de la muestra).

8. Clasificación celular

1. Separar las células utilizando 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%, ver Tabla de materiales), centrifugar y resuspender el pellet con 190 μL de PBS−⁻.
2. Añadir 10 μL de un anticuerpo anti-FITC antihumano conjugado fluorescente (dilución 1:20, ver Tabla de materiales) e incubar la suspensión celular a 4 °C durante 30 min.
3. Lave las células con 10 ml de PBS−⁻, centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y resuspender el pellet en 300 μL de PBS−⁻.
4. Aislar y recolectar células CD31 positivas (CD31+) mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), utilizando una boquilla de 100 μm, y recogerlas en un tubo.
   1. Según la estrategia de compuerta, primero defina la morfología celular utilizando los parámetros del área de dispersión lateral, SSC-A y FSC-A. Luego, seleccione celdas individuales usando un diagrama de puntos FSC-Area/FSC-Height o SSC-Area/SSC-Height, defina las celdas positivas en la muestra marcada frente a la muestra de control no teñida y dirija las células fluorescentes al tubo de recolección²¹.
5. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente, y suspender el pellet en 2 ml de medio de crecimiento para sembrar en los pocillos pre-recubiertos de una placa de 6 pocillos.

9. Expansión posterior a la clasificación

1. Dos días después de la clasificación celular, reemplace el medio acondicionado con un medio de crecimiento fresco.
2. Repita los pasos 7.1 y 7.2 cada 2 días para la expansión celular.

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Resultados

Aislamiento HLMEC
El principal problema durante el aislamiento de HLMVEC es la presencia de células contaminantes, ya que los capilares microscópicos no se pueden separar fácilmente del tejido estromal. Por lo tanto, lograr la mayor pureza posible en las primeras etapas del proceso de aislamiento es crucial para reducir los pasajes de cultivo y, por lo tanto, el envejecimiento celular. Del mismo modo, un protocolo de aislamiento óptimo debe proporcionar el mayor rendimiento posible de HLMVEC puros...

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Discusión

Las múltiples funciones desempeñadas por las células endoteliales vasculares en la fisiopatología humana hacen de estas células una herramienta indispensable para los estudios patogénicos y farmacológicos in vitro . Dado que las CE de diferentes sitios vasculares / órganos muestran características y funciones peculiares, la disponibilidad de CE sanas y enfermas del órgano de interés sería ideal para fines de investigación. Por ejemplo, los HLMVEC son esenciales para los estudios sobre la inflamació...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%