Dielectroforesis inducida por luz para caracterizar el comportamiento eléctrico de células madre mesenquimales humanas

Resumen

Aquí, presentamos la dielectroforesis inducida por la luz como un enfoque sin marcado para caracterizar líneas celulares heterogéneas, específicamente células madre mesenquimales humanas (hMSC). Este artículo describe un protocolo para usar y optimizar un dispositivo microfluídico con una capa fotoconductora para caracterizar el comportamiento eléctrico de las hMSC sin alterar su estado nativo.

Resumen

Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) ofrecen una fuente de células derivadas del paciente para realizar estudios mecanicistas de enfermedades o para varias aplicaciones terapéuticas. Comprender las propiedades de hMSC, como su comportamiento eléctrico en varias etapas de maduración, se ha vuelto más importante en los últimos años. La dielectroforesis (DEP) es un método que puede manipular células en un campo eléctrico no uniforme, a través del cual se puede obtener información sobre las propiedades eléctricas de las células, como la capacitancia y la permitividad de la membrana celular. Los modos tradicionales de DEP utilizan electrodos metálicos, como electrodos tridimensionales, para caracterizar la respuesta de las células a DEP. En este artículo, presentamos un dispositivo microfluídico construido con una capa fotoconductora capaz de manipular células a través de proyecciones de luz que actúan como electrodos virtuales in situ con geometrías fácilmente conformables. Aquí se presenta un protocolo que demuestra este fenómeno, llamado DEP inducido por luz (LiDEP), para caracterizar hMSCs. Mostramos que las respuestas celulares inducidas por LiDEP, medidas como velocidades celulares, pueden optimizarse variando parámetros como el voltaje de entrada, los rangos de longitud de onda de las proyecciones de luz y la intensidad de la fuente de luz. En el futuro, prevemos que esta plataforma podría allanar el camino para tecnologías que no tengan etiquetas y realicen la caracterización en tiempo real de poblaciones heterogéneas de hMSC u otras líneas de células madre.

Introducción

Las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) son reconocidas por sus propiedades inmunosupresoras¹, que han llevado a su uso en terapias para el tratamiento de una variedad de enfermedades, como la diabetes tipo II², la enfermedad de injerto contra huésped³ y la enfermedad hepática⁴. Las HMSC son heterogéneas y contienen subpoblaciones de células que se diferencian en adipocitos, condrocitos y osteoblastos. Las HMSC se derivan del tejido adiposo, el tejido del cordón umbilical y la médula ósea, y su potencial de diferenciación depende del tejido de origen y del proceso de cultivo celular utilizado⁵. Por ejemplo, según un estudio de Sakaguchi et al., las hMSCs derivadas del tejido adiposo tienen más probabilidades de diferenciarse en adipocitos, mientras que las hMSCs derivadas de la médula ósea tienen más probabilidades de diferenciarse en osteocitos⁶. Sin embargo, el impacto del origen tisular de las hMSCs en su potencial de diferenciación es un fenómeno que aún necesita ser entendido más a fondo. Además, los variados potenciales de diferenciación de las hMSC contribuyen a su heterogeneidad inherente y crean desafíos en la aplicación de hMSCs para la terapéutica. Como tal, la caracterización, así como la clasificación, de líneas heterogéneas de células madre es fundamental para desarrollar la aplicación in vitro y clínica de estas células. La citometría de flujo, la técnica estándar de oro para examinar las diferencias en los fenotipos celulares, utiliza antígenos de la superficie celular y colorantes fluorescentes para marcar las células diana y caracterizarlas en función de la dispersión de la luz o las características de fluorescencia específicas de la célula ^6,7,8. Las desventajas de este método incluyen la disponibilidad limitada de biomarcadores de antígenos de superficie celular, el alto costo del equipo y la operación, y el hecho de que la tinción de la superficie celular podría dañar potencialmente la membrana celular y afectar las aplicaciones terapéuticas 9,10,11. Por lo tanto, explorar nuevas técnicas para la caracterización celular sin comprometer el estado nativo de la membrana celular podría beneficiar el rendimiento clínico de la terapéutica con células madre.

La dielectroforesis (DEP), un método de caracterización celular que no utiliza etiquetas de superficie, es el foco de este trabajo actual. DEP es un método sin etiquetado o sin tinción implementado en plataformas microfluídicas para caracterizar poblaciones heterogéneas de células en función de sus propiedades eléctricas. DEP utiliza un campo eléctrico de corriente alterna (CA) en reemplazo de la tinción de fluorescencia (es decir, un método basado en etiquetas)⁷. Las otras ventajas del uso de dispositivos microfluídicos basados en DEP para la caracterización celular incluyen el uso de volúmenes pequeños (microlitros), tiempo de análisis rápido, requisitos mínimos de preparación de muestras celulares, riesgo mínimo de contaminación de muestras, producción mínima de desechos y bajo costo^12,13. Otro beneficio de DEP es el monitoreo en tiempo real de las células^14,15,16. Para DEP, las células en suspensión están expuestas a un campo eléctrico de CA no uniforme creado con electrodos, y se polarizan⁶. Esta polarización provoca el movimiento de la celda y permite la manipulación de la celda en función de la frecuencia y el voltaje del campo eléctrico de CA aplicado. Al ajustar la frecuencia, típicamente entre 5 kHz y 20 MHz, las células pueden ser atraídas o repelidas lejos de los electrodos, lo que corresponde al comportamiento DEP positivo y negativo, respectivamente⁶.

Existen múltiples modos de caracterización DEP, a saber, tradicional, fraccionamiento de flujo de campo e inducido por luz, según lo clasificado por su configuración de electrodos y/o estrategia operacional¹⁷. El analizador 3DEP, un modo tradicional de DEP, incorpora electrodos metálicos físicos y monitorea la respuesta celular a un campo eléctrico de CA. Este sistema utiliza un chip formado por micropocillos con múltiples electrodos circulares tridimensionales y detecta cambios en las intensidades de luz para caracterizar el comportamiento DEP celular 18,19,20,21. El DEP positivo se observa a medida que las células se mueven hacia los bordes de los electrodos circulares a lo largo de las paredes del micropozo, lo que resulta en un aumento de la intensidad de la luz en el centro del micropozo. El DEP negativo se observa como células que se agrupan en el centro del micropozo lejos de los electrodos circulares, lo que resulta en una disminución de la intensidad de la luz en el centro del micropozo. Estos dos fenómenos se representan en la Figura 1. Los métodos tradicionales de DEP tienen la capacidad de caracterizar las propiedades eléctricas de poblaciones celulares heterogéneas 18,20,21. Por ejemplo, Mulhall et al. demostraron el potencial para distinguir entre queratinocitos orales normales (HOK) y líneas celulares de queratinocitos orales malignos (H357) basándose en las diferencias en la capacitancia de membrana²¹ utilizando el analizador 3DEP. Sin embargo, una limitación de los modos tradicionales de DEP es la geometría del electrodo fijo. Dado que las hMSC son heterogéneas, es ventajoso tener la capacidad de modificar fácilmente las geometrías de los electrodos durante las evaluaciones DEP. Por ejemplo, poder modificar los electrodos o las matrices de electrodos en tiempo real para la captura de una sola célula permite caracterizar las células en función de la velocidad y el comportamiento DEP. La aplicación de la modificación de electrodos en tiempo real en las evaluaciones DEP de hMSC permite el análisis de una sola célula de hMSC inmediatamente después de obtenerlos del tejido de muestra para caracterizar la heterogeneidad de la población de la muestra.

Para superar la limitación de los modos tradicionales de DEP (es decir, electrodos físicos fijos) y explorar nuevas oportunidades para modificaciones de la configuración de electrodos en tiempo real utilizando el fenómeno DEP, se ha explorado DEP inducido por luz (LiDEP). LiDEP es un modo no tradicional de DEP que manipula células utilizando un dispositivo microfluídico fotoconductor^22,23 a través de proyecciones de luz, los electrodos localizados crean un campo eléctrico no uniforme^, similar al método DEP tradicional. Este enfoque también permite flexibilidad en la geometría del electrodo y para mover los electrodos dentro del dispositivo microfluídico. Esto mitiga la limitación observada con electrodos fijos y brinda la oportunidad de obtener más información sobre la heterogeneidad celular. LiDEP se ha utilizado para detectar y analizar diferentes tipos celulares en poblaciones homogéneas y heterogéneas de células^22,23,24. Por ejemplo, Liao et al. utilizaron LiDEP para separar las células tumorales circulantes (CTC) que expresan el módulo de adhesión de células epiteliales (EpCAM^neg) de los glóbulos rojos para explorar su importancia en la metástasis del cáncer²². El análisis unicelular con LiDEP se ha utilizado con éxito para caracterizar y manipular células cancerosas con la estratificación de la tumorigenicidad pancreática²³ y el análisis de CTC en muestras antes y después de la metástasis²⁴.

Aquí, describimos cómo se puede utilizar LiDEP para manipular hMSC con una variedad de geometrías de electrodos (círculo, diamante, estrella y líneas paralelas) y configuraciones del sistema (voltaje aplicado, intensidad de luz y material del dispositivo microfluídico), ofreciendo así un enfoque para caracterizar el comportamiento de las células madre derivadas de humanos con electrodos virtuales.

Protocolo

1. Fabricación de dispositivos microfluídicos LiDEP

NOTA: El proceso de fabricación consiste en combinar tres componentes en capas: (i) una capa fotoconductora con silicio amorfo (A: Si) y molibdeno depositado sobre un sustrato de vidrio de óxido de indio y estaño (ITO); ii) una capa de microcanales cortada de cinta de doble cara; y (iii) un sustrato de vidrio ITO superior con orificios perforados para la entrada y salida de la suspensión celular.

1. Recubrimiento de vidrio de óxido de indio y estaño fotoconductor (ITO)
   1. Limpie el sustrato de vidrio recubierto con ITO (15-20 Ω resistencia) haciendo fluir gas nitrógeno (_N2) en la superficie a un caudal que sea suficiente para mover partículas de polvo visibles. Después de este paso, enjuague el sustrato con acetona.
   2. Transfiera el portaobjetos de vidrio recubierto con ITO a un baño de alcohol isopropílico para lavar el residuo de acetona, enjuague con agua DI y vuelva a fluir gas_N2 hasta que el sustrato esté completamente seco.
   3. Coloque la diapositiva de vidrio con el lado recubierto ITO hacia arriba en el sistema de pulverización catódica al vacío.
   4. Pulverizar una capa de molibdeno de 10 nm de espesor sobre el sustrato de vidrio recubierto con ITO (objetivo de molibdeno) con una tasa de deposición de 0,7 Å/s y un tiempo de deposición de 140 s.
   5. Agregue una máscara de sombra a un lado del sustrato de vidrio para dejar 2 mm desde el borde del sustrato de vidrio descubierto para conexiones eléctricas. Depósito de 1 μm de A:Si utilizando deposición química de vapor mejorada por plasma acoplado inductivamente (ICP-PECVD), como se describe en Medjdoub et ^al.25.
   6. Limpie el portaobjetos con gas_N2 para eliminar el polvo y otras impurezas. Para cualquier A:Si depositado bajo la máscara de sombra, sumerja el borde hasta la marca de 2 mm en una solución de hidróxido de potasio al 25% p/v para grabar el A:Si.
2. Fabricación de dispositivos de chip LiDEP
   1. Para formar el microcanal, obtenga cinta de doble cara (52 mm x 25 mm) y perfore agujeros (diámetro = 4 mm) a 5-6 mm del borde de la dimensión más corta y centrados entre los lados más largos de la cinta. Use un bisturí para cortar dos líneas rectas (separadas por 3 mm) a través de los agujeros. Asegúrese de que las láminas protectoras en ambas caras de la cinta de doble cara estén colocadas durante todo el paso de corte del microcanal.
   2. Perfore dos orificios de 3 mm de diámetro en la corredera de vidrio ITO superior. La cinta se puede alinear en la parte superior del vidrio recubierto con ITO, con el borde largo de la cinta alineado con el borde largo del vidrio. Marque la ubicación del orificio con un marcador lavable. Asegúrese de que los orificios perforados se alineen con los orificios perforados en la cinta de doble cara. Estos dos orificios actuarán como los orificios de entrada y salida del dispositivo microfluídico.
   3. Retire un lado de la película protectora de la cinta de doble cara, alinee los orificios de la cinta y la corredera de vidrio ITO superior y presiónelos juntos. Presione suavemente para eliminar las bolsas de aire, especialmente cerca del microcanal. Las bolsas de aire pueden permitir que el medio u otras soluciones se filtren debajo de la cinta, lo que puede dañar o causar moho en el dispositivo microfluídico.
   4. Retire la otra película protectora de la cinta de doble cara y presione sobre el lado de vidrio ITO recubierto de molibdeno y A:Si. Haga coincidir el borde de la diapositiva fotoconductora que está opuesta al lado libre de 2 mm con el borde de la cinta de doble cara que está hacia el centro de la diapositiva de vidrio ITO superior. Habrá resaca de la diapositiva de vidrio ITO superior y la diapositiva de vidrio ITO recubierta de material fotoconductor.
   5. Presione sobre una superficie plana para asegurar una buena adherencia. En la Figura 1A se ilustra un esquema del sustrato de vidrio y las capas de cinta de doble cara. Corte el exceso de cinta en el lateral.
   6. Aplique cinta de cobre a los bordes de la capa A y la capa C para conectar el generador de funciones. Haga esto envolviendo la cinta en el lado del ITO o material fotoconductor, dependiendo de si es capa A o capa C, desde el borde de la cinta de doble cara hasta aproximadamente 3 cm en el lado no recubierto del sustrato de vidrio.
   7. Para garantizar una fabricación exitosa del dispositivo, use un multímetro para probar una lectura de resistencia entre los portaobjetos recubiertos de ambos sustratos de vidrio y la cinta de cobre que estaba unida al vidrio.
3. Preparación del búfer DEP
   1. Mida 4,25 g de sacarosa y colóquela en un tubo cónico de 50 ml. Luego, mida 0.15 g de glucosa y colóquelo en el mismo tubo cónico de 50 ml.
   2. Llene el tubo cónico con 25 ml de agua ultrapura, cierre la tapa y mezcle. Una vez que aproximadamente la mitad de la sacarosa y la glucosa se hayan disuelto, llene el tubo cónico con agua ultrapura hasta la línea de 50 ml. Mezclar vigorosamente hasta que toda la sacarosa y la glucosa se disuelvan. La solución tampón DEP contiene 8,5% (p/v) de sacarosa y 0,3% (p/v) de glucosa.
   3. Obtenga 20 ml de la solución preparada de sacarosa y glucosa, y colóquela en un tubo cónico de 50 ml. Luego, mida 0.1 g de albúmina sérica bovina (BSA) y colóquela en el tubo cónico de 50 ml que contiene la solución de sacarosa y glucosa. Vórtice hasta que se disuelva el BSA. La solución tampón DEP final contiene 0,5% (p/v) de BSA.
4. Preparación celular
   1. Obtener al menos 1 x 10⁶ células (hMSCs o HEK 293) suspendidas en 1 mL de medio de crecimiento utilizando el protocolo de cultivo celular descrito en estudios previos^26,27. Coloque la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 10 ml.
   2. Centrifugar las células HEK 293 a 201 x g durante 5 min y las hMSCs a 290 x g durante 10 min. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de la solución tampón DEP con BSA al 0,5%. Asegúrese de no agregar la solución tampón demasiado rápido porque pueden formarse burbujas.
   3. Repita el proceso de centrifugación dos veces más y luego resuspenda las células en el tampón DEP con BSA al 0,5% para la caracterización de LiDEP. El protocolo de preparación celular enumerado es suficiente para 10 ejecuciones. Por ejemplo, una prueba de frecuencia requiere al menos 15 series y, por lo tanto, se deben hacer 2 ml de células a una concentración de 1 x 10⁶ células / ml.

2. Caracterización de LiDEP

1. Configuración experimental
   1. Ensamble el siguiente equipo para la configuración experimental para cuantificar las respuestas celulares a LiDEP: una computadora portátil, un proyector, una lente objetiva, un microscopio digital y un generador de funciones. Utilice el portátil para diseñar las proyecciones de luz (estrella, diamante, tres líneas y óvalo) y conéctelo al proyector.
   2. Utilice el proyector como fuente de luz para mostrar las proyecciones de luz en la superficie fotoconductora (capa C) del chip LiDEP. Configúrelo para que la luz de la fuente de luz (proyector) viaje a través de una lente de objetivo 10x hacia la región del microcanal del chip LiDEP. La lente del objetivo 10x se encuentra en la parte superior de la lente del proyector. La figura complementaria 1 muestra la integración del proyector en el sistema LiDEP.
   3. Conecte el chip LiDEP al generador de funciones para aplicar el campo eléctrico de CA. Observe las células que experimentan la fuerza LiDEP utilizando el microscopio digital para obtener imágenes y grabar videos. La figura 1B muestra un esquema del aparato experimental. Siga los protocolos estándar de cultivo celular^26,27 para todas las células analizadas.
2. Procedimientos experimentales
   1. Enjuague el microcanal con etanol al 70%, seguido de una solución de BSA al 0,5%. Enjuague el microcanal nuevamente con solución BSA al 0,5% dos veces más para asegurarse de que el etanol y las células anteriores se eliminen por completo. Las células que ya han sido expuestas al campo DEP responderán de manera diferente a las células nuevas y pueden interrumpir la recopilación de datos.
   2. Retire la solución BSA al 0,5% con una pipeta y coloque el dispositivo microfluídico en el soporte del dispositivo.
   3. Conecte pinzas de cocodrilo a cada una de las conexiones de cinta de cobre del dispositivo. Ajuste el generador de funciones a la tensión deseada (voltaje pico a pico, V_pp) y frecuencia (Hz). El rango de frecuencia probado aquí fue de 30 kHz a 20 MHz.
   4. Agregue 70 μL de suspensión celular (células + solución tampón DEP con BSA al 0,5%) en el microcanal del dispositivo. Debido a la delgadez del microcanal (~0,05 mm), puede producirse un derrame de los orificios de entrada y salida. Para ayudar a reducir la cantidad de derrame, use una punta de pipeta más pequeña e incline la punta ligeramente en el orificio hacia el microcanal. Cualquier solución de acceso (BSA al 0,5% o células en solución) puede limpiarse con toallitas de papel de un solo uso y desecharse en residuos de riesgo biológico.
   5. Proyecte la geometría del electrodo virtual deseado (aquí, círculos, diamantes, estrellas y/o líneas paralelas) en el chip LiDEP.
   6. En el software del microscopio digital, ajuste la duración del video a 3 min. Ajuste un temporizador de laboratorio a 2 min 30 s. Una vez que las celdas estén estacionarias en el microcanal del chip LiDEP, presione Inicio en el software del microscopio digital para comenzar el proceso de grabación de video.
   7. Espere 10 s, luego presione el botón ON de la salida del canal del generador de funciones para aplicar el campo eléctrico de CA y presione Inicio para el temporizador. Monitoree el comportamiento del DEP celular a través del microscopio digital y evite temblores o movimientos alrededor de la configuración.
   8. Una vez que el temporizador se apague, presione el botón ON de la salida del canal del generador de funciones. Esto apaga la salida del canal del generador de funciones y el campo eléctrico de CA ya no se suministra a través de los electrodos. Detenga la grabación de video a los 3 minutos y guárdela en el microscopio digital para futuros análisis.
   9. Pipetear las células fuera del extremo de salida del chip LiDEP empujando lentamente 60 μL de tampón DEP con BSA al 0,5% en el microcanal y recogiendo simultáneamente en la salida. Continúe hasta que haya poca o ninguna célula en el microcanal.
   10. Repita los pasos 2.2.3-2.2.9 hasta que se hayan probado todas las frecuencias.

Resultados

Las pruebas de voltaje y color del electrodo se completaron utilizando el procedimiento anterior con una ligera variación en los pasos 2.2.3 y 2.2.10. Para la prueba de voltaje, el color y la frecuencia del electrodo permanecieron constantes, y se aplicaron₅ V pp, 10 V pp y 20 V_pp. Para la prueba de color del electrodo, el voltaje y la frecuencia aplicados se mantuvieron constantes a 30 kHz y 20 V_pp, y se examinaron los electrodos proyectados azul, rojo, blanco y amarillo (referenciados por los códigos de color HEX #4472C4, #FF0000, #FFFFFF y #FFFF00, respectivamente). La viabilidad celular se examinó tiñendo las células con azul de tripano y contando el número de células vivas y muertas utilizando un hemocitómetro.

Con la configuración de LiDEP, pudimos manipular las hMSC y generar curvas de respuesta DEP en respuesta a la frecuencia de entrada, que es una forma de caracterizar el comportamiento eléctrico de las células. Se realizaron una serie de experimentos para encontrar las condiciones óptimas de operación manipulando parámetros como el voltaje aplicado y el color del electrodo proyectado (es decir, formas con colores distintos creados con un software editor gráfico) para observar el comportamiento consistente de la celda al campo eléctrico de CA no uniforme generado con los electrodos virtuales. Los datos recopilados para las respuestas celulares utilizando LiDEP, DEP no tradicional, se compararon con los resultados del analizador 3DEP, DEP tradicional.

La primera prueba de optimización se centró en la respuesta DEP positiva de los hMSC (es decir, las células que se mueven hacia el electrodo virtual) en el chip LiDEP. Las células que no exhibían una respuesta DEP positiva mostraban una respuesta DEP negativa al alejarse del electrodo virtual, estaban estacionarias y giratorias, o no respondían al campo eléctrico. La respuesta de las células se cuantificó mediante el seguimiento de sus velocidades (μm / s) en ImageJ durante un período de 2 min 30 s. Se utilizó una proyección ovalada amarilla para el electrodo virtual, y se examinaron los voltajes aplicados de 5 V pp, 10 V pp y 20 V_pp a una frecuencia establecida de 30 kHz. Nos centramos en las células que estaban dentro de los 50 μm del electrodo virtual mientras el campo eléctrico de CA estaba encendido para la consistencia y minimizar los valores atípicos. Los 20 V pp resultaron en el movimiento celular más rápido de las células HEK 293, con una velocidad promedio de 0.035 μm / s, y esto fue seguido por 0.032 μm / s a 10 V pp y 0.020 μm / s a 5 V_pp, lo que significa que estas células representan un control relativamente homogéneo. Se observó una tendencia similar para las hMSC, que tenían una velocidad promedio de 0,051 μm/s a 20 V pp, 0,036 μm/s a 10 V pp y 0,025 μm/s a 5 V _pp, como en la Figura 2A (aquí, * indica p < 0,05). A 20 V_pp, se observó que las hMSCs experimentaron DEP positivo y negativo simultáneamente. Esto no se observó a 10 V pp y 5 V pp. Los hallazgos de viabilidad de las hMSCs después de experimentar la fuerza DEP mostraron que los voltajes más altos generalmente resultaron en una menor viabilidad celular, con 66% de células viables a 5 V pp, 58% de las células viables a 10 V pp y 57% de las células viables a 20 V _pp, como en la Figura 2B (aquí, ** indica p < 0.01).

Debido a que LiDEP es un sistema óptico, la intensidad de la luz y el color del electrodo son parámetros que se pueden ajustar fácilmente para controlar el rendimiento del chip LiDEP. Aquí, se evaluaron diferentes colores de electrodos (blanco, amarillo, rojo y azul) generados en función de la forma proyectada para determinar el efecto sobre las respuestas DEP de las células. Las células HEK 293 y las hMSC se evaluaron a 20 V_pp y 30 kHz. Se eligieron electrodos de color blanco, amarillo, rojo y azul, pero la iluminación a través del chip LiDEP se vio afectada por la capa fotoconductora, que tenía un color rojo-naranja. Por lo tanto, el electrodo blanco proyectado apareció amarillo con un interior blanco, el electrodo rojo apareció naranja con un contorno rojo y el electrodo azul apareció verde claro (Figura 3A-D). Las salidas de potencia para estos cuatro colores fueron las siguientes: 77.7 μW ± 0.7 μW, 92.7 μW ± 1.3 μW, 21.9 μW ± 0.2 μW y 56.7 μW ± 0.9 μW para blanco, amarillo, rojo y azul, respectivamente. Esto sugiere fuertemente que el amarillo y el blanco tenían el campo DEP más fuerte, mientras que el azul y el rojo eran más débiles, como en la Figura 3E (aquí, *** indica p < 0.001 para celdas HEK 293 y ** indica p < 0.01 para hMSCs). También se observó rotación estacionaria de las celdas en los bordes de los electrodos virtuales amarillos y blancos durante la aplicación de la fuerza DEP. Para todas las variaciones de color del electrodo, se produjeron respuestas DEP negativas y positivas simultáneas, correlacionándose con lo que se mostró a 20 V_pp para la prueba de voltaje. Además, mientras que la velocidad de las células variaba según el color del electrodo, casi todas las células dentro del límite de 50 μm respondieron a LiDEP. El tamaño de las hMSCs se midió como 19,2 μm ± 5,8 μm.

Para evaluar la capacidad de LiDEP en comparación con DEP con electrodos convencionales, evaluamos las diferencias entre el comportamiento DEP de las células que usan LiDEP y el de las células analizadas por el analizador 3DEP. La respuesta DEP de las hMSCs se midió en una solución tampón DEP de baja conductividad con BSA al 0,5% (~100 μS/cm). Para imitar el analizador 3DEP, se proyectó un solo electrodo virtual amarillo ovalado a 10_{V pp}. El comportamiento DEP de las hMSCs se caracterizó de 30 kHz a 20 MHz. A frecuencias inferiores a 25 kHz, observamos electrólisis, lo que resultó en la generación de burbujas en la superficie de la capa metálica dentro del dispositivo microfluídico. Para LiDEP, a frecuencias más bajas, las hMSC experimentaron una fuerza DEP positiva, como en la Figura 4A, representada como el porcentaje de células atraídas por el electrodo virtual. Las células comenzaron con una fuerte fuerza DEP positiva, que se debilitó a medida que aumentaba la frecuencia. Las células experimentaron la fuerza DEP positiva más fuerte de 30 kHz a 97 kHz. Después de aplicar el campo eléctrico de CA a estas frecuencias, algunas células dejaron de responder, mientras que otras células mostraron un comportamiento DEP negativo. Esta tendencia se desvía de la respuesta observada cuantificada utilizando el analizador 3DEP; las células aumentaron en DEP positivo de 37 kHz a 255 kHz y disminuyeron en DEP positivo de 1.772 kHz a 20 MHz, como en la Figura 4B.

Figura 1: Configuración experimental para el protocolo LiDEP descrito aquí para hMSCs. (A) Imagen esquemática y real del chip LiDEP con la capa fotoconductora y la configuración experimental. (B) Imágenes representativas de las respuestas DEP positivas y negativas de las células en el analizador 3DEP (utilizando electrodos DEP convencionales, arriba) y representación esquemática de las respuestas DEP positivas y negativas de las células utilizando LiDEP (utilizando proyecciones de luz como electrodos virtuales, abajo). (C) Ejemplos de diferentes formas que se pueden proyectar en el dispositivo como electrodos virtuales. Figura creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Caracterización de las respuestas DEP (velocidad) de hMSCs y su viabilidad en las condiciones dadas. (A) Las velocidades medidas de las respuestas DEP positivas de hMSCs a 5 V pp, 10 V pp y 20 V _pp. Las hMSCs se movieron a 0,051 μm/s a 20 V pp, 0,036 μm/s a 10 V pp y 0,025 μm/s a 5 V_pp. (B) La viabilidad de los hMSCs después de experimentar la fuerza DEP positiva generada con electrodos virtuales. La viabilidad fue del 57%, 58% y 66% para₂₀ V pp, 10 V pp y 5 V_pp, respectivamente. Las barras de error representan la desviación estándar (DE). Análisis estadístico completado en conjuntos de datos agrupados utilizando pruebas t (*p < 0,05 y **p < 0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación de las respuestas DEP entre líneas celulares homogéneas (HEK 293) y heterogéneas (hMSCs). Respuesta DEP positiva de las células hMSCs a electrodos (A) blancos, (B) amarillos, (C) rojos y (D) azules a 20 V_pp y 30 kHz. (E) Respuestas de velocidad de las células HEK 293 y hMSC a los electrodos de diferentes colores. Las células HEK 293 exhibieron las velocidades más altas con los electrodos amarillo y rojo a 0.035 μm / s y 0.033 μm / s, respectivamente. Las celdas HEK 293 exhibieron la velocidad más baja con los electrodos azules a 0.027 μm / s. Las hMSC exhibieron las velocidades más altas con los electrodos amarillo y blanco a 0.068 μm / s y 0.049 μm / s, respectivamente. Las hMSC experimentaron la velocidad más baja con los electrodos rojos a 0,039 μm/s. Las barras de error representan el SD. Análisis estadístico completado en conjuntos de datos agrupados utilizando pruebas t (*p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Comparación de las respuestas DEP de hMSCs usando LiDEP y 3DEP. Las respuestas DEP de hMSCs medidas con (A) LiDEP y (B) el analizador 3DEP a 10 V_pp. Con LiDEP, hubo una disminución en la respuesta DEP positiva de los hMSC de 30 kHz a 20 MHz. Desde el analizador 3DEP, las células aumentaron en DEP positivo de 37 kHz a 255 kHz y disminuyeron en DEP positivo de 1.772 kHz a 20 MHz. Las barras de error representan la SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Imágenes representativas de la configuración de LiDEP utilizada para los experimentos en este protocolo. Imagen ampliada del sistema LiDEP que muestra la integración del proyector. La luz viaja desde la fuente (proyector) a través de una lente objetivo 10x hasta el microcanal del chip LiDEP. El objetivo 10x se encuentra en la parte superior de la lente del proyector. Cada componente está numerado en las imágenes y se enumera en el lateral. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 1: Video representativo de hMSCs respondiendo a los electrodos virtuales blancos, amarillos, rojos y azules. Las células se visualizan como experimentando DEP positivo (moviéndose hacia el electrodo virtual), experimentando DEP negativo (alejándose del electrodo virtual), estacionario y giratorio, o no respondiendo al campo eléctrico. Los hMSC se probaron a 37 kHz y 20 V_pp, y el video se aceleró 20x. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Examinar la heterogeneidad de las hMSCs es importante para su avance en la terapéutica. Este trabajo proporciona un primer paso para utilizar LiDEP como herramienta analítica para la evaluación de hMSCs. Examinamos la dependencia del voltaje de la respuesta DEP positiva de las células en LiDEP cuantificando la velocidad. Se espera que los voltajes más altos produzcan una fuerza DEP positiva más fuerte, y observamos este patrón con las velocidades medidas. Los voltajes de 10 V pp y 20 V_pp fueron suficientes para la manipulación de hMSCs usando LiDEP. Los voltajes más bajos (es decir, 5 V_pp) dieron como resultado respuestas de celda más lentas; aunque no es óptimo para las hMSC, esto podría ser ventajoso para otros tipos de células. Hubo una disminución dependiente del voltaje en la viabilidad de las hMSC de aproximadamente el 9%. Esto difiere ligeramente de la literatura previa 6,12,28,29^, en la que el uso de DEP y LiDEP tradicionales en el examen de células biológicas no disminuyó la viabilidad celular. Sin embargo, el objetivo experimental en cada estudio varió. Glasser y Fuhr monitorizaron el crecimiento de fibroblastos adherentes de ratón L929 en electrodos metálicos en medio de cultivo celular²⁸. Por el contrario, Lu et al. examinaron la viabilidad de las células madre neurales expuestas a campos eléctricos de CA durante diferentes períodos de tiempo¹². Adams et al. caracterizaron las propiedades dieléctricas de hMSCs con electrodos metálicos¹², y Li et al. manipularon células leucémicas con LiDEP²⁹. La diferencia entre estos estudios y los nuestros fue el uso de BSA, que puede ser la causa de la disminución de la viabilidad observada. Sin embargo, la menor viabilidad global también puede deberse al tiempo de exposición (2 min 30 s) utilizado en el protocolo aquí establecido. Este tiempo fue elegido para proporcionar suficiente tiempo para visualizar la manipulación celular durante la exposición al campo eléctrico de CA no uniforme.

Los métodos de caracterización celular se probaron a través del color del electrodo para determinar las capacidades y limitaciones de nuestro sistema LiDEP construido como se describe en el protocolo. En este protocolo específico, el color del electrodo se puede controlar en función del color de la forma que se proyecta a través de un archivo de editor gráfico. Utilizamos cuatro colores: blanco, amarillo, rojo y azul. A partir de las lecturas de potencia de salida para cada color, se midieron los electrodos amarillo (#FFFF00) y blanco (#FFFFFF) proyectados para tener intensidades más altas, que fue la base de por qué estos colores fueron más favorables para usar en los experimentos posteriores. Además, debido a la dependencia establecida de la intensidad de la luz de los materiales fotoconductores^30,31, los resultados sugieren que el rendimiento de los dispositivos LiDEP se basa en A:Si fotoconductor y puede ajustarse mediante la elección del color del electrodo proyectado. También se observó una combinación de respuestas DEP positivas y negativas de hMSCs utilizando LiDEP, que es como el fenómeno observado en los métodos DEP tradicionales. Con cada color de electrodo, los hMSC experimentaron fuerza DEP negativa, fuerza DEP positiva y rotación celular, lo que indica que la muestra de celda era heterogénea a una sola frecuencia (Video suplementario 1). Esto concuerda con los hallazgos de Adams et ^al.6 de que las hMSCs exhiben un comportamiento DEP negativo y positivo con una sola frecuencia. Estas condiciones (color del electrodo, forma del electrodo y material fotoconductor) pueden proporcionar parámetros adicionales para detectar el nivel de heterogeneidad en las muestras de hMSC.

Por último, los resultados de la evaluación LiDEP se compararon con los resultados del analizador 3DEP como punto de referencia del comportamiento de hMSC DEP. Se observó una diferencia en el rango de frecuencia de la respuesta DEP positiva de las hMSC, pero las tendencias en los datos recopilados a través de LiDEP y el analizador 3DEP fueron similares en general (es decir, la respuesta DEP positiva disminuyó con el aumento de la frecuencia). Cuando el campo eléctrico de CA se suministró al chip LiDEP y se proyectó luz sobre él, la conductancia en el área dentro de la proyección de luz cayó, creando un campo eléctrico no uniforme. Por lo tanto, las características de la fuente de luz (es decir, intensidad y longitud de onda) influyen en la respuesta esperada de las células dentro del chip LiDEP, como se ve en los resultados de las pruebas de variación de voltaje y color del electrodo. Otros parámetros que se pueden modificar son el material de la capa fotoconductora y la conductividad de la solución tampón DEP. Como tal, las condiciones utilizadas para evaluar el comportamiento DEP de las células deben evaluarse en función de la configuración del sistema LiDEP. Por el contrario, para el analizador 3DEP, u otros métodos que utilizan electrodos metálicos para aplicar la fuerza DEP, las características del electrodo son constantes y no se pueden variar instantáneamente para adaptarse a lo que se necesita para las células bajo investigación. Esta variación del comportamiento DEP positivo podría ser beneficiosa para futuras investigaciones sobre la caracterización de diferentes tipos de células dentro de muestras de hMSC, análisis de células individuales o clasificación celular. Además, a medida que las células se alejan de los electrodos virtuales, el campo eléctrico de CA se debilita. Sin embargo, con el analizador 3DEP, u otros modos DEP tradicionales que utilizan electrodos metálicos, se puede aplicar una región de campo eléctrico más grande, lo que permite manipular más celdas. Por lo tanto, menos células por experimento LiDEP experimentaron los efectos del campo eléctrico de CA dentro del microcanal del chip LiDEP. Otras discrepancias pueden ser causadas por cambios en el rendimiento del dispositivo a lo largo del tiempo (es decir, 2 h o 3 h), que aún se está investigando. El flujo constante de agua, etanol y solución tampón DEP podría romper la superficie de la capa de microcanal (es decir, el material fotoconductor) y debe considerarse. El rendimiento del dispositivo a lo largo del tiempo para la caracterización celular también debe considerarse para el uso extendido de un chip LiDEP. Las modificaciones de los parámetros experimentales en tiempo real solo tomaron de unos segundos a minutos. El color y las geometrías del electrodo se ajustaron instantáneamente utilizando la configuración del software del editor gráfico.

En resumen, este artículo demuestra las capacidades de LiDEP para manipular y caracterizar una línea celular con poblaciones celulares heterogéneas como hMSCs. Usando esta configuración y el protocolo descrito, pudimos lograr la caracterización exitosa de hMSCs bajo las condiciones de 20 V_pp y electrodos amarillos virtuales proyectados. Los estudios futuros deben centrarse en ajustar el tiempo de exposición de las hMSC al campo eléctrico de CA creado a través de LiDEP, aumentar la intensidad de la luz de los electrodos virtuales y evaluar diferentes fuentes de hMSC (u otras poblaciones de células madre) para desarrollar un catálogo LiDEP de las firmas eléctricas de poblaciones heterogéneas de células madre.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300054
10x objective	AmScope	---
Amorphous silicon (A:Si)	Millipore Sigma	S5130
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240-062
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9706-100
Copper Tape	Zehhe	BF4964
Dextrose (glucose)	Fisher	D16-1
Digital microscope	Keyence	VHX-7000
Double Sided Tape	Insulectro	FLX000484
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Fetel Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
Function Generator	Tektronix	AFG 31102
Graphic editor software	Microsoft Office Powerpoint	---
Indium tin oxidec coated glass slides	MSE Supplied	GL0333
L-Alanyl-L-Glutamine	ATCC	PCS-999-034
Laptop	Dell	Inspiron 14, 2-in-1
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium	ATCC	PCS-500-030
Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs	ATCC	PCS-500-040
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X)	Giblo	A10490-01
Molybdenum, 99.95%	Kurt J. Lesker	EJTMOXX352A4	Sputtering target
Phenol Red	Sigma	P5530
Power Meter	Thor Labs	S130VC/PM400
Projector	Vecupoi	---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media	Gibco	11875-093	This media has L-Glutamine and Phenol Red.
Sucrose	Fisher	BP220-1
Trypan Blue Stain	Gibco	15250-061	0.40%
Trypsin Neutralizer	Gibco	R002100
Vacuum Sputtering System	Denton	DV-502M