Aislamiento y purificación del β-glucano fúngico como estrategia de inmunoterapia para el glioblastoma

Resumen

El presente protocolo describe los pasos de purificación y los estudios posteriores de cuatro β-glucanos fúngicos diferentes como moléculas inmunomoduladoras potenciales que mejoran las propiedades antitumorales de la microglía contra las células de glioblastoma.

Resumen

Uno de los mayores desafíos en el desarrollo de terapias efectivas contra el glioblastoma es superar la fuerte supresión inmune dentro del microambiente tumoral. La inmunoterapia se ha convertido en una estrategia eficaz para convertir la respuesta del sistema inmunitario en contra de las células tumorales. Los macrófagos asociados al glioma y la microglía (GAM) son los principales impulsores de tales escenarios antiinflamatorios. Por lo tanto, mejorar la respuesta anticancerosa en los GAM puede representar una posible terapia coadyuvante para tratar a los pacientes con glioblastoma. En ese sentido, las moléculas fúngicas de β-glucano se conocen durante mucho tiempo como potentes moduladores inmunes. Se ha descrito su capacidad para estimular la actividad inmune innata y mejorar la respuesta al tratamiento. Esas características moduladoras se atribuyen en parte a su capacidad para unirse a los receptores de reconocimiento de patrones, que, curiosamente, se expresan en gran medida en los GAM. Por lo tanto, este trabajo se centra en el aislamiento, purificación y posterior uso de β-glucanos fúngicos para mejorar la respuesta tumoricida de la microglía contra las células de glioblastoma. Las líneas celulares de glioblastoma de ratón (GL261) y microglia (BV-2) se utilizan para probar las propiedades inmunomoduladoras de cuatro β-glucanos fúngicos diferentes extraídos de hongos muy utilizados en la industria biofarmacéutica actual: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus y Ganoderma lucidum. Para probar estos compuestos, se realizaron ensayos de coestimulación para medir el efecto de un medio preactivado condicionado por microglía sobre la proliferación y la activación de la apoptosis en las células de glioblastoma.

Introducción

A pesar del advenimiento de nuevos logros en el campo de la neurooncología, la esperanza de vida de los pacientes con glioblastoma sigue siendo escasa. Las terapias estándar de oro contra los tumores cerebrales se basan en la fusión de cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, en la última década, la inmunoterapia se ha convertido en una poderosa estrategia para tratar diferentes tipos de cáncer¹. Por lo tanto, la posibilidad de aprovechar la respuesta inmune del cuerpo contra las células tumorales se ha convertido recientemente en el cuarto pilar de la oncología.

Desde hace tiempo se sabe que uno de los mayores desafíos en el campo es superar la fuerte inmunosupresión que se encuentra dentro del microambiente tumoral². En particular, en el caso del glioblastoma, una de las formas más comunes y agresivas de cáncer cerebral, desentrañar las vías clave que orquestan tales escenarios protumorales y encontrar nuevos compuestos que podrían contrarrestar la respuesta deprimente del sistema inmunológico podría allanar el camino para futuras terapias contra esta enfermedad incurable.

El cerebro posee sus propias células del sistema inmunológico, y el tipo de célula más relevante es la microglía. Se ha demostrado que estas células tienen un comportamiento bastante complejo en diferentes enfermedades centrales³. En el caso de los tumores cerebrales primarios (por ejemplo, glioblastoma), estas células se desplazan hacia un fenotipo antiinflamatorio que apoya a las células tumorales para colonizar el parénquima cerebral³. Numerosas publicaciones han mejorado el papel principal de estas células durante la progresión tumoral. Una de las principales razones de esto es que la microglía asociada al glioma y los macrófagos infiltrados (GAMs) representan un tercio de la masa tumoral total, lo que sugiere la influencia inequívoca de sus estados de activación durante la progresión del tumor cerebral ^4,5.

En ese sentido, los β-glucanos fúngicos han sido descritos como moléculas potentes que desencadenan respuestas inmunes efectivas, incluyendo fagocitosis y producción de factores proinflamatorios, lo que lleva a la eliminación de agentes perniciosos 6,7,8,9,10. Los β-glucanos fúngicos generalmente se han estudiado utilizando extractos de diferentes partes de hongos. Sin embargo, la atribución de efectos específicos requiere su purificación para evitar ambigüedades y poder comprender el mecanismo de acción de tales moléculas como agentes inmunomoduladores⁸.

En este trabajo, los β-glucanos solubles se purifican del cuerpo fructífero de cuatro hongos diferentes, empleados regularmente como hongos comestibles (Pleurotus ostreatus y Pleurotus djamor) y medicinales (Ganoderma lucidum y Hericium erinaceus). En particular, estos cuatro hongos tienen un gran uso en la industria alimentaria y farmacéutica y se produjeron dentro de una economía circular respetuosa con el medio ambiente en una empresa comercial (ver Tabla de materiales).

Con el fin de sentar las bases para el uso futuro de β-glucanos fúngicos en terapias contra el cáncer cerebral, las estrategias de purificación bien definidas y los estudios preclínicos que profundizan en su supuesta interacción con las células del sistema inmune son esenciales para evaluar su papel potencial como mediadores antitumorales. Este trabajo describe los numerosos pasos de aislamiento y purificación necesarios para recuperar los β-glucanos solubles contenidos dentro de los cuerpos fructíferos del hongo seleccionado. Una vez purificadas con éxito, las células microgliales se activan para mejorar su fenotipo inflamatorio. Las células de glioblastoma de ratón (GL261) se recubren con un medio diferente condicionado por microglía, previamente tratado con estos extractos, y luego se evalúa su efecto sobre el comportamiento de las células tumorales. Curiosamente, los estudios piloto de nuestro laboratorio (datos no mostrados) han descubierto cómo la microglía proinflamatoria puede retrasar la migración de células tumorales y las propiedades de invasión no solo en las células de glioblastoma sino también en otras líneas celulares cancerosas. Este trabajo multidisciplinario puede proporcionar una herramienta útil para que los investigadores oncológicos prueben compuestos prometedores capaces de aumentar la respuesta inmune en muchos tipos diferentes de tumores.

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Protocolo

Las cuatro variantes diferentes de hongos descritas en este protocolo se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).

1. Aislamiento de β-glucanos fúngicos

1. Extracción y aislamiento de polisacáridos solubles de hongos
   NOTA: Los polisacáridos solubles de hongos (SMP) se obtuvieron de acuerdo con el procedimiento esquemáticamente mostrado en la Figura 1.
   1. Enjuague suavemente los cuerpos fructíferos frescos de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus y G. lucidum (aproximadamente 2,000 g / hongo) en agua destilada cinco veces.
   2. Secar los cuerpos frutales a 50 ± 2 °C en un horno de secado al aire convencional hasta alcanzar un peso constante (~24 h).
   3. Moler los champiñones secos en un molino de cuchillas, obteniendo unos 200 g de polvo de cada hongo.
   4. Suspender 100 g de hongos en polvo (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus y G. lucidum) en 1.000 mL de_H2Od. A continuación, autoclave a 121 °C durante 15 min, y finalmente dejar a temperatura ambiente durante 30 min.
   5. Centrifugar la suspensión resultante a 6.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   6. Secar el precipitado que contiene polisacáridos de setas insolubles (IMP) a 50 ± 2 °C en un horno de secado al aire durante 24 h.
   7. Deseche el precipitado y conserve el sobrenadante. Concentrar el sobrenadante 10 veces en un evaporador rotativo.
   8. Precipitar el concentrado que contiene SMP con etanol (80% de concentración final) a 4 °C durante la noche.
   9. Centrifugar la suspensión de etanol a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C, retener el pellet (precipitado) y desechar el sobrenadante con una pipeta.
   10. Lavar el precipitado tres veces con etanol al 80% antes de disolverlo en_H2Od(10% p/v). Ajustar el pH a 6.5/7 y la temperatura a 37 °C, y tratar con 2 u y 4 U de α-amilasa y glucoamilasa, respectivamente, para solubilizar α-glucanos siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).
   11. Después del tratamiento con α-amilasa/glucoamilasa, ajustar el pH y la temperatura a 8,0 y 50 °C, respectivamente, y tratar con alcalasa (2,5 U/g de proteína) (ver Tabla de materiales) para solubilizar las proteínas.
       NOTA: Este tratamiento enzimático secuencial elimina la mayoría de los α-glucanos y proteínas que coprecipitan con β-glucanos en la precipitación de etanol.
   12. Después de la hidrólisis, centrifugar el hidrolizado a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C, y el sobrenadante limpio concentrar cinco veces en un evaporador rotativo. Precipitar de nuevo con etanol al 80%.
   13. Solubilizar el precipitado resultante en_H2ODy dializar en agua destilada durante 24 h utilizando membranas de tubos de celulosa (membranas de corte de 12.000 Da; ver Tabla de materiales) para eliminar moléculas de bajo peso molecular. Recupere la porción soluble en agua y liofilifíquela para producir β-glucanos solubles (SβGs).
2. Medición de azúcar y proteínas
   1. Medir el contenido total de azúcar de cada fracción por el método de ácido fenol-sulfúrico, utilizando la glucosa como estándar⁸.
      NOTA: La cuantificación del contenido de β-glucano también se puede hacer utilizando el kit de ensayo de β-glucano (hongos y levadura; ver Tabla de materiales), basado en la hidrólisis enzimática y la actividad de las oxidorreductasas: a saber, exo-1,3-β-glucanasa, glucosa oxidasa, β-glucosidasa y peroxidasa, con la posterior formación de la quinoneimina. Siga las instrucciones del fabricante, con ligeras modificaciones.
   2. Utilice 18 MH 2 SO4 en lugar de 12 MH₂SO₄.
   3. Evalúe el contenido de los glucanos totales y α-glucanos por separado.
   4. Mida los valores de β-glucano resultantes como la diferencia entre los valores de glucano total y α-glucano (triplicado) siguiendo el protocolo Kjeldahl. En ciertos casos, el contenido de proteína puede determinarse por el método de Lowry, utilizando albúmina para trazar la curva de calibración^11,12.
3. Análisis de espectroscopia de absorción ultravioleta
   1. Obtenga los espectros ultravioleta (UV) SβG utilizando un espectrofotómetro UV-visible (ver Tabla de materiales) escaneando las muestras en la región de 200-400 nm (Figura 2).
   2. Preparar 1,0 mg/ml de cada SβG en_H2OD, transferir la solución a una cubeta de cuarzo y escanear a temperatura ambiente.
4. Análisis de distribución de peso molecular
   1. Estimar la homoegeneidad de SβGs y el peso molecular de los polímeros por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) utilizando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (ver Tabla de materiales) equipado con un detector de índice de refracción y una columna lineal de filtración de gel ultrahidrogel (300 mm x 7,8 mm; Figura 3).
   2. Realizar el ensayo a 40 °C utilizando agua desionizada como eluyente a un caudal de 0,5 ml/^min-1 y dextranos (110, 80 y 50 kDa) como patrones (ver Tabla de materiales). Recoja una fracción de 5 ml.
5. Análisis infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR)
   1. Registre los espectros infrarrojos (Figura 4) en un espectrómetro FTIR en el rango de 4000-500 ^cm-1. Las muestras deben mezclarse previamente con KBr para formar películas (procedimiento FTIR estándar; consulte las instrucciones del fabricante y la Tabla de materiales).
6. Análisis de composición molecular
   1. Estimar las composiciones moleculares de SβGs mediante cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), siguiendo procedimientos estándar¹².

2. Estudio in vitro de la estimulación de la microglía inducida por β-glucano

1. Cultivo celular de células de glioblastoma y microglía de ratón en portaobjetos de cámara de 8 pocillos
   NOTA: Este protocolo es específico para las líneas celulares GL261 (glioblastoma) y BV2 (microglia). Sin embargo, con ligeras modificaciones, estos pasos podrían usarse potencialmente para estudiar otras líneas celulares cancerosas e inmunitarias.
   1. Prepare el medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco modificado con L-glutamina, 4,5 g/L de D-glucosa y sin piruvato. Agregue 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabla de materiales). Precaliente el material en un baño maría a 37 °C durante 15 min.
   2. Descongele las alícuotas BV2 y GL261 congeladas en un baño maría (37 °C) durante 2 min, y justo antes de descongelarlas por completo, llévelas a una campana de flujo laminar y coloque las células en dos matraces T25 estériles diferentes (uno para cada línea celular).
   3. Incubar los matraces T25 a 37 °C, 5%_CO2 hasta que el cultivo sea confluente.
      NOTA: Dependiendo de las condiciones de congelación y el tiempo bajo criopreservación, el tiempo hasta la confluencia puede variar. Estas líneas celulares suelen requerir entre 3 y 5 días para alcanzar la confluencia en un matraz T75.
   4. Después de que el cultivo celular BV2 se vuelva confluente, transfiéralo a portaobjetos de cámara de 8 pocillos 0.6 x 10⁶ células/pocillo. Mantenga los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos en la incubadora durante 24 h.
   5. Una vez que las células microgliales estén colocadas en los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos, repita el mismo protocolo con las células GL261.
2. Activación de la microglía con β-glucanos
   1. Cubra las células BV2 con cuatro β-glucanos diferentes (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus) a una concentración de 0,2 mg/ml durante 72 h. Una condición experimental debe permanecer sin tratar (medio normal), actuando como el grupo de control.
   2. Recoger el sobrenadante con una pipeta después de 72 h y pasar el volumen restante a través de un filtro de jeringa de 0,20 μm. A continuación, congelar el sobrenadante a -80 °C durante al menos 24 h.
3. Tratamiento de GL261 con medio preactivado condicionado por microglía
   1. Una vez que el GL261 esté 80% confluente dentro de los portaobjetos de cámara de 8 pocillos, añadir medio microglial tratado con β glucano (paso 2.2.2) a una concentración volumétrica final del 25% durante 72 h (volumen total: 250 μl/pocillo).
   2. Retirar el medio después de 72 h de incubación y desecharlo.
   3. Lave las células con solución salina tampón fosfato (PBS; pH 7.4, 0.1 M) tres veces durante 5 minutos.
   4. Fijar las células añadiendo 200 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) a 4 °C durante 15 min.
      NOTA: Dependiendo de los diferentes anticuerpos que podrían usarse para la inmunofluorescencia, los métodos de fijación pueden diferir del PFA típico al 4%. Los fijadores a base de alcohol pueden ser más eficientes para preservar ciertos epítopos.
4. Estudio de inmunofluorescencia
   1. Lave las muestras con PBS con tritón X (PBST; 0,01%) durante 10 min tres veces.
   2. Retire el PBST y agregue el tampón de bloqueo de albúmina sérica bovina (BSA) al 10% en PBST (Tabla 1) durante 30 min a temperatura ambiente.
   3. Retire el tampón de bloqueo y agregue 200 μL por pocillo de PBS que contenga la mezcla primaria de anticuerpos (anticuerpo monoclonal Ki-67 de rata 1:500 y anticuerpo caspasa-3 hendido de conejo 1:500; ver Tabla de materiales). Incubar durante la noche a 4 °C.
   4. Después de 24 h de incubación a 4 °C, dejar las muestras a temperatura ambiente durante 30 min.
   5. Lave los pocillos tres veces durante 10 minutos con PBS en un agitador (baja velocidad).
   6. Retire el PBS y reemplácelo con 200 μL por pocillo de PBS que contenga la mezcla de anticuerpos secundarios (1:200 anti-rata IgG (H + L) anticuerpo secundario altamente adsorbido de adsorción, Alexa Fluor 488 y 1:200 burro anti-conejo IgG (H + L) anticuerpo secundario altamente adsorbido de forma cruzada, Alexa Fluor 647; ver Tabla de materiales) durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
   7. Lave las muestras con PBS durante 10 minutos en una coctelera multiusos.
   8. Retirar el PBS y añadir 200 μL por pocillo de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluido en PBS (1:5.000) durante 1 min.
   9. Retire DAPI (ver Tabla de materiales) y lave las celdas durante 5 minutos en PBS.
   10. Retire el marco del pocillo y agregue 50 μL de PBS: glicerol (1: 1) en cada pocillo y cubra con un cubreobjetos.
   11. Selle los portaobjetos con esmalte de uñas.
   12. Adquiera imágenes a 20x utilizando un sistema de microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales).

3. Cuantificación y análisis de la proliferación y apoptosis de células tumorales

NOTA: Para medir el efecto potencial de los diferentes β-glucanos sobre la proliferación y apoptosis de células tumorales, se utilizó un script interno en el software ImageJ para cuantificar el número de píxeles positivos de Ki67 (proliferación) y cCasp3 (apoptosis)¹³.

1. Abra ImageJ. Haga clic en el botón Plugins . Haga clic en Coloc2, un complemento previamente instalado en la carpeta del complemento, y finalmente seleccione la imagen^{a analizar 11}.
   NOTA: Este plugin estaba disponible después de un contacto previo con el Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). En lugar del script, tanto el software ImageJ como el de Fiji tienen diferentes herramientas para el análisis de colocalización (ver Tabla de materiales), con propiedades similares.
2. Establezca umbrales de acuerdo con las condiciones de control (sin tratar, solo DMEM). Haga clic en el botón Aceptar .
   NOTA: Para evitar discrepancias de fondo e intensidad, todas las imágenes deben tomarse en las mismas condiciones. Preferiblemente, las sesiones de imágenes deben realizarse el mismo día y los parámetros del microscopio no deben alterarse en todas las imágenes.
3. Asegúrese de que aparezcan las imágenes resultantes de los píxeles colocalizados y una ventana de resumen que proporcione el porcentaje o el número bruto de píxeles por encima del umbral. Normalizar los resultados con respecto a las condiciones de control (no tratadas).
   NOTA: Todos los datos se dan como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando software de gráficos y análisis (ver Tabla de materiales). Se utilizó un ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los errores se representan como error estándar de la media (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).

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Resultados

Purificación exitosa de β-glucanos
La masa de MP, SMPs y SβGs obtenida de cuerpos fructíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus después del proceso de extracción y purificación se resume en la Tabla 1. La composición básica (carbohidratos totales, β-glucanos y proteínas) de MP, SMPs y SβGs obtenidos de los hongos se representa en la Tabla 2. Estos resultados muestran cómo el protocolo permitió la re...

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Discusión

Este trabajo describe el uso de técnicas bien establecidas para aislar, purificar y caracterizar con éxito el contenido de SβGs de cuatro hongos diferentes. Los resultados mostraron cómo después de la extracción con agua caliente de SMP, obtenida de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus, seguida de un tratamiento hidrolítico con α-amilasa, glucosidasa y proteasa, el contenido de α-glucano y proteína se redujo, enriqueciendo significativamente la cantidad de SβG ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chamber slides	Thermo Fisher, USA	171080
Air-drying oven	J.P. Selecta S.A., Spain	2000210
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis	A7030
Alcalase	Novozymes, Denmark	protease
Alexa Fluor 488	Thermofisher, USA	A32731
Alexa Fluor 647	Thermofisher, USA	A32728
Blade mill	Retsch, Germany	SM100
Bovine Serum Albumin	MERK, Germany	A9418
Cellulose tubing membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis	D9402
Centrifuge	MERK, Germany	Eppendorf, 5810R
Colocalisation pluggins	ImageJ		(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI	MERK, Germany	28718-90-3
Dextrans	Pharmacosmos, Holbalk, Denmark	Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase)	Novozymes, Denmark
Fetal bovine serum	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
FT-IR spectromete	Bruker-Vertex, Switzerland	VERTEX 70v
Graphing and analysis software	GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC system	Waters Corp, Milford, MA, USA	Waters 2695 HPLC
Incubator	Eppedorf	Galaxy 170S
Mass Spectometer	Q Exactive GC, Thermo Scientific	725500
Paraformaldehyde	MERK, Germany	P6148
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
pH meter	Crison, Barcelona, Spain	Basic 20
Phosphate-buffered saline	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Abcam, UK	ab243998
Rat Ki-67 Monoclonal	Thermofisher, USA	MA5-14520
Rotary evaporator	Büchi Ibérica S.L.U., Spain	El Rotavapor R-100
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)	Waters Corp, Milford, MA, USA	WAT011545
UV-Visible spectrophotometer	Amersham Bioscience, UK	Ultrospec 2100 pro
VectaMount	Vector Laboratories, C.A, USA	H-5000-60
Water bath	J.P. Selecta S.A., Spain
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.	Zeiss, Germany
β-glucan Assay Kit	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	K-BGLU
β-glucans	Setas y Hongos del Sur, S.L.		Supplied the four variants of mushrooms