Disección de ratones del sistema nervioso central y periférico completo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para completar la disección de los sistemas nerviosos central y periférico de ratones. Los tejidos disecados se analizan más a fondo en aplicaciones posteriores, como la toma de imágenes macroscópicas o la histología.

Resumen

Los modelos animales representan el caballo de batalla del campo de la neurociencia. A pesar de esto, hoy en día, todavía no existe un protocolo paso a paso para diseccionar un sistema nervioso completo de roedores, ni existe un esquema completo que lo represente y que esté disponible libremente. Solo se dispone de métodos para extraer el cerebro, la médula espinal, un ganglio específico de la raíz dorsal y el nervio ciático (por separado). Aquí, proporcionamos imágenes detalladas y un esquema del sistema nervioso murino central y periférico. Más importante aún, describimos un procedimiento sólido para realizar su disección. El paso de predisección de 30 minutos permite aislar el sistema nervioso intacto dentro de la vértebra con músculos libres de vísceras y piel. A continuación, se realiza una disección de 2 a 4 horas bajo un microscopio de disección para exponer la médula espinal y los nervios torácicos, y finalmente despegar todo el sistema nervioso central y periférico de la canal. Este protocolo representa un importante avance en el estudio de la anatomía y fisiopatología del sistema nervioso a nivel global. Por ejemplo, los ganglios de la raíz dorsal disecados de un modelo de ratones con neurofibromatosis tipo I se pueden procesar posteriormente para la histología a fin de desentrañar los cambios en la progresión tumoral.

Introducción

El objetivo general de este método es aislar el sistema nervioso central y periférico de un ratón en una sola pieza. Actualmente no existe un protocolo para diseccionar todo el sistema nervioso de un roedor para estudiarlo a nivel global. Los neurocientíficos suelen utilizar el nervio ciático como sustituto de cualquier nervio periférico¹, y los ganglios L3 a L5² como sustituto de cualquier ganglio. Con estos métodos, es imposible concluir si los resultados son específicos para el nervio o ganglio en particular. Como se sabe que al menos algunas patologías nerviosas no afectan a todos los nervios y ganglios por igual ^3,4,5, es necesario desarrollar una técnica que permita aislar todo el sistema nervioso de los roedores para estudiarlo globalmente.

A lo largo de los años, hemos desarrollado y perfeccionado un método para diseccionar los sistemas nerviosos central y periférico completos de ratones. El primer paso es esencialmente una disección macroscópica de los ratones en preparación para los pasos de microdisección bajo el microscopio de disección. En los pasos 2 a 4, se exponen la médula espinal y los nervios torácicos, se disecciona el cerebro y se despegan toda la médula espinal y los nervios periféricos del cadáver.

Este método es poderoso cuando se combina con imágenes o histología para documentar cualquier cambio macroscópico o microscópico 6,7,8,9. Los neurocientíficos interesados en estudiar el cambio global o realizar experimentos no basados en hipótesis deberían utilizar este método para estudiar el sistema nervioso global.

Protocolo

Los protocolos utilizados en este estudio han sido aprobados por el Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, una institución certificada por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal.

1. Preparación para la microdisección (predisección)

1. Realizar anestesia con isoflurano al 5%, seguida de eutanasia con isoflurano al 2% y 10 psi de CO₂ hasta que no haya signos vitales.
   NOTA: No realice luxación cervical, ya que esto daña la médula espinal y los ganglios cervicales.
2. Coloque el ratón sacrificado boca arriba (vista anterior) sobre una almohadilla de disección y rocíe el pelaje con etanol al 70%.
3. A continuación, sujeta las extremidades superiores e inferiores, utilizando cuatro clavijas de pequeño diámetro para mantener al ratón en posición durante la disección.
4. Con unas tijeras quirúrgicas, corte la piel desde la parte inferior del abdomen hasta la garganta.
5. Despegue la piel para exponer los órganos internos y use alfileres adicionales para mantener la piel a cada lado mientras expone la cavidad abdominal.
6. Abra la caja torácica para exponer el corazón y los pulmones.
7. Con un par de pinzas anatómicas estándar, agarre el esófago y la tráquea, y corte justo por encima de las pinzas.
8. Luego, comience a despegar todos los órganos internos en un enfoque craneal a caudal. Para ello, corta el diafragma a lo largo de la columna vertebral para eliminar todos los órganos internos de una sola pieza.
9. Desengancha el ratón y enjuaga el exceso de sangre de ratón de la cavidad abdominal en un fregadero.
10. Coloque el ratón boca abajo (vista posterior). Sujete las extremidades superiores e inferiores, usando cuatro alfileres para mantener al ratón en posición durante la disección.
11. Con unas tijeras quirúrgicas, retire la piel desde la cabeza hasta las extremidades traseras.
12. Exponga el nervio ciático izquierdo (miembro inferior).
    1. Corta los músculos de la parte inferior de la extremidad inferior izquierda.
    2. Localice y exponga el nervio ciático mediante la extirpación del músculo que lo rodea.
    3. Cortar con cuidado el nervio ciático en la ramificación de los nervios sural, tibial y peroneo, y preservar los vasos sanguíneos.
    4. Continúe aislando el nervio ciático con pinzas anatómicas estándar y tijeras Bonn extrafinas, hasta que quede paralelo a la columna vertebral, dejando un nervio libre de unos 2 cm.
    5. Inserte las tijeras quirúrgicas paralelas a la médula espinal y corte la cadera.
    6. Disloque la cadera separando el sacro y el fémur con los dedos.
       NOTA: Durante este proceso, es necesario detenerse con frecuencia para tirar suavemente del nervio ciático con fórceps para evitar interrupciones.
    7. Al final, arranca delicadamente la extremidad trasera del cadáver del ratón, dejando un nervio ciático de unos 4 cm de longitud.
       NOTA: Durante este proceso, localice el nervio L2 y sáquelo de la extremidad posterior para evitar daños en el L2. Repita el paso 1.12 para el lado derecho.
13. Exponga los nervios braquiales (miembros superiores).
    1. Manipule la carcasa del ratón con las manos, en lugar de sobre una superficie plana (almohadilla de disección).
    2. Localiza el plexo braquial izquierdo separando la grasa y los músculos de la axila izquierda.
    3. Una vez localizados, cortar las principales ramificaciones del plexo braquial (radial, axilar, supraescapular) y sus subramificaciones alrededor del cúbito con unas tijeras de Bonn extrafinas, dejando libres los nervios de alrededor de 1,5 cm. Despegue suavemente el plexo de la extremidad superior izquierda.
    4. Dislocación de la extremidad superior izquierda; Asegúrate de que esté libre de nervios. Repita el paso 1.13 para el lado derecho.
14. Exponer el cerebro.
    1. Ahora, coloque el mouse boca arriba (vista anterior)
    2. Inserte una hoja de las tijeras Bonn extra finas en la boca y corte la mandíbula a través de la garganta.
    3. Retire la mandíbula cortando desde las mejillas hasta la garganta.
    4. Luego, corta el hueso del cráneo que pasa de una oreja a la otra.
       NOTA: Tenga cuidado de evitar profundizar demasiado y dañar el cerebro.
    5. Corta y retira el paladar y los huesos nasales para abrir el cráneo.
    6. Corta la vértebra C1 en la base del cráneo, liberando el cerebelo y el comienzo de la médula espinal.
    7. Finalmente, corte el cráneo transversalmente hasta el ojo y retire las piezas del cráneo para exponer el cerebro.
       NOTA: Mantenga el cerebro en su cavidad hasta que se despeguen los nervios.
15. Retira el exceso de grasa o músculos de la carcasa. Coloque la carcasa en formalina al 10% durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT), seguido de breves lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x hasta que no haya más olor a fijador, y continúe con el siguiente paso.
    NOTA: Si se disecciona el sistema nervioso en las próximas 2 semanas, guárdelo a 4 °C en PBS. De lo contrario, guárdelo en formol al 10% indefinidamente. Utilice siempre una campana química cuando manipule formalina.

2. Exposición de la médula espinal

1. Para exponer la médula espinal, use un abordaje de cráneo a caudal. Para extirpar cada vértebra y su capa muscular de arriba, corte en las posiciones de las diez en punto y las dos en punto en el lado ventral, usando tijeras de resorte Vannas. Seccione la vértebra con minipinzas Dumont. Continúe este proceso a través de las vértebras cervicales y torácicas.
2. Para la sección lumbar, corte la apófisis transversal a cada lado de la vértebra. Luego, corte en las posiciones de las dos en punto y las diez en punto insertando la hoja de un par de tijeras de resorte Vannas en el canal vertebral. Retire los tejidos, prestando atención a los nervios que a veces están pegados a los huesos.
3. Proceda de manera similar para la parte caudal.

3. Exposición del nervio torácico

1. Coloque el cadáver bajo el microscopio de disección para visualizar la cara anterior.
2. Con las tijeras de resorte Vannas, corte a lo largo de cada costilla (desde el esternón hasta las extremidades inferiores) para exponer los nervios periféricos.
3. A continuación, corte la vértebra a ambos lados (lateralmente) del ganglio para exponer el ganglio.

4. Despegue de los nervios periféricos

1. Para despegar la médula espinal y desalojar aún más los nervios periféricos, use las minipinzas Dumont para enrollar suavemente la médula espinal y extraer los nervios uno por uno, comenzando con la parte caudal de la médula espinal.
   NOTA: Antes de despegar, se puede realizar una fijación adicional en formalina al 10% durante 15 minutos en RT, seguida de breves lavados 1x PBS hasta que no haya más olor a fijador, como se realiza en el paso 1.15.
2. Para la parte torácica, tire del nervio en un ángulo de 90° (perpendicular a la médula espinal).
3. Para el plexo braquial, corte la vértebra junto al nervio, para dejar espacio para el nervio.
   NOTA: El plexo braquial no puede pasar por debajo de la vértebra, como en la región torácica.
4. Retira el exceso de músculos para despejar los nervios.
5. Almacenar en PBS a 4 °C hasta por un total de 2 semanas, o indefinidamente en formalina al 10% en RT.

Resultados

Los roedores han sido fundamentales para nuestra comprensión de la biología y la fisiopatología del sistema nervioso¹⁰. Curiosamente, ningún método presenta la disección completa del sistema nervioso central y periférico de un roedor para evaluar la anatomía y la variación patológica en un modelo en tiempo real ^1,2,11. La Figura 1 p...

Discusión

Para evitar que los músculos y los nervios se sequen, la carcasa debe remojarse en PBS cada 10 minutos. Al dislocar las extremidades inferiores (paso 1.12.6), es importante tener siempre a la vista el plexo del nervio ciático y la L2 para evitar dañarlo/desgarrarlo. Al diseccionar el cerebro (paso 1.14.4), es fundamental evitar profundizar demasiado para no dañar el cerebro. Al diseccionar los ganglios de la raíz dorsal y los nervios periféricos en general, es fundamental utilizar ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont mini-forceps	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn scissors	Fine Science Tools	#14084-08
Formalin 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
Standard anatomical forceps	Fine Science Tools	#91100-12
Surgical scissors	Fine Science Tools	#140001-12
Vannas spring scissors	Kent Scientific	#INS600124