Monitorización de la pexofagia mediada por Stub1

Resumen

Este protocolo proporciona instrucciones para desencadenar y monitorear la pexofagia mediada por Stub1 en células vivas.

Resumen

Las células de mamíferos pueden voltear los peroxisomas a través de la pexofagia mediada por Stub1. La vía potencialmente permite el control celular de la cantidad y calidad de los peroxisomas. Durante este proceso, la proteína de choque térmico 70 y la ubiquitina E3 ligasa, Stub1, se translocan en los peroxisomas para ser volteados para iniciar la pexofagia. La actividad de la ligasa Stub1 permite la acumulación de ubiquitina y otros módulos relacionados con la autofagia en peroxisomas específicos. La elevación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz peroxisomal puede activar la pexofagia mediada por Stub1. Por lo tanto, se puede utilizar la generación de ROS asistida por colorante para desencadenar y monitorear esta vía. Este artículo describe los procedimientos para usar dos clases de colorantes, proteínas fluorescentes y fluoróforos sintéticos, para iniciar la pexofagia dentro de cultivos celulares de mamíferos. Estos protocolos basados en la generación de ROS asistidos por colorante no solo se pueden usar para atacar todos los peroxisomas dentro de una población celular a nivel mundial, sino que también pueden permitir la manipulación de peroxisomas individuales dentro de células individuales. También describimos cómo se puede seguir la pexofagia mediada por Stub1 utilizando microscopía de células vivas.

Introducción

Los peroxisomas son orgánulos unidos a una sola membrana presentes en la mayoría de las células eucariotas. Los peroxisomas son un compartimento metabólico esencial para llevar a cabo la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga, catabolismo de purina y síntesis de fosfolípidos y ácidos biliares^{éter 1}. La acetil-CoA derivada de peroxisomas controla la homeostasis lipídica regulando la señalización central en el metabolismo². Por lo tanto, no es de extrañar que las funciones peroxisomales comprometidas estén implicadas en diversas enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos, enve....

Protocolo

1. Preparación de células que expresan diKillerRed o proteínas automarcantes (SLP) en la luz del peroxisoma

1. Siembra las células deseadas en placas de cultivo celular con fondo de vidrio. Para el experimento aquí, sembrar 2 x 10⁵ células SHSY5Y humanas en 840 μL de medio de cultivo (DMEM / F-12 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina / estreptomicina) o 6 x 10 4 células NIH3T3^{de ratón en} 840 μL de medio de cultivo (DMEM suplementado con 10% de suero bovino y 1% de penicilina/estreptomicina) en una placa de cultivo de 35 mm con un micropocillo de vidrio de 20 mm de diámetro.
   NOTA: El número de cél....

Resultados

El esquema de inducción de pexofagia mediado por Stub1 que se muestra aquí aprovecha la generación de ROS asistida por colorante dentro de la luz del peroxisoma. Esta operación requiere intensidades de luz mínimas. Por lo tanto, los peroxisomas que contienen proteínas o colorantes fluorescentes pueden iluminarse utilizando microscopios confocales estándar de barrido láser. La iluminación focal conduce a la producción instantánea y localizada de ROS dentro de los peroxisomas individuales, como lo indica el repo.......

Discusión

Este protocolo detalla cómo desencadenar la pexofagia mediada por Stub1 dentro de cultivos celulares elevando los niveles de ROS peroxisomales con luz. Como el protocolo se basa en la generación de ROS asistida por colorante, es necesario garantizar una expresión suficiente de diKillerRed-VKSKL o tinción de ligando SLP marcada con colorante dentro de las células de interés. Dado que diferentes tipos de células o células de diferentes antecedentes genéticos pueden albergar peroxisomas con propiedades ligeramente .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
bovine serum	ThermoFisher Scientific	16170060
Cell culture incubator	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70	Academia Sinica		Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10437028
HaloTag TMR ligand	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Inverted Confocal Microscope	Olympus	FV3000RS	405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668	transfection reagent
NIH3T3 cell	ATCC	CRL-1658	adherent
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	reduced serum media
penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell	ATCC	CRL-2266	adherent