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  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo proporciona instrucciones para desencadenar y monitorear la pexofagia mediada por Stub1 en células vivas.

Resumen

Las células de mamíferos pueden voltear los peroxisomas a través de la pexofagia mediada por Stub1. La vía potencialmente permite el control celular de la cantidad y calidad de los peroxisomas. Durante este proceso, la proteína de choque térmico 70 y la ubiquitina E3 ligasa, Stub1, se translocan en los peroxisomas para ser volteados para iniciar la pexofagia. La actividad de la ligasa Stub1 permite la acumulación de ubiquitina y otros módulos relacionados con la autofagia en peroxisomas específicos. La elevación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz peroxisomal puede activar la pexofagia mediada por Stub1. Por lo tanto, se puede utilizar la generación de ROS asistida por colorante para desencadenar y monitorear esta vía. Este artículo describe los procedimientos para usar dos clases de colorantes, proteínas fluorescentes y fluoróforos sintéticos, para iniciar la pexofagia dentro de cultivos celulares de mamíferos. Estos protocolos basados en la generación de ROS asistidos por colorante no solo se pueden usar para atacar todos los peroxisomas dentro de una población celular a nivel mundial, sino que también pueden permitir la manipulación de peroxisomas individuales dentro de células individuales. También describimos cómo se puede seguir la pexofagia mediada por Stub1 utilizando microscopía de células vivas.

Introducción

Los peroxisomas son orgánulos unidos a una sola membrana presentes en la mayoría de las células eucariotas. Los peroxisomas son un compartimento metabólico esencial para llevar a cabo la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga, catabolismo de purina y síntesis de fosfolípidos y ácidos biliareséter 1. La acetil-CoA derivada de peroxisomas controla la homeostasis lipídica regulando la señalización central en el metabolismo2. Por lo tanto, no es de extrañar que las funciones peroxisomales comprometidas estén implicadas en diversas enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos, envejecimiento, cáncer, obesidad y diabetes 3,4,5. Un proceso esencial en el mantenimiento de la operación peroxisomal es la pexofagia. La pexofagia es un proceso catabólico para el recambio selectivo de peroxisomas por autofagia. Las células utilizan la pexofagia para ayudar a controlar la cantidad y calidad de los peroxisomas, asegurando así una función peroxisomal adecuada. Un estudio reciente demostró que la pérdida de peroxisomas causada por mutaciones en los factores de biogénesis peroxisomal PEX1 1 y 6 resulta de la pexofagia no controlada6. En particular, el 65% de todos los pacientes con trastorno de biogénesis de peroxisomas (PBD) albergan deficiencias en el complejo ATPasa AAA peroxisomal, compuesto por PEX1, PEX6 y PEX26 en células de mamíferos7.

Se pueden utilizar varios métodos para iniciar y estudiar la pexofagia. En la levadura, la pexofagia se desencadena cuando los nutrientes suministrados se cambian de fuentes de carbono dependientes del peroxisoma a fuentes de carbono independientes del peroxisoma (para reducir el número de peroxisomas celulares)8. Por ejemplo, la transferencia de células de Pichia pastoris cultivadas con metanol del medio metanol al medio de glucosa y al medio de etanol induce micropexofagia y macropexofagia, respectivamente 8,9,10. Los secuestros de micropexofagia agrupan los peroxisomas para su degradación mediante la remodelación de la vacuola para formar membranas de secuestro vacuolar en forma de copa y una estructura similar a una tapa denominada aparato de membrana específico de micropexofagia (MIPA). En la macropexofagia, los peroxisomas individuales son engullidos por estructuras de doble membrana conocidas como pexofagosomas, seguidas de fusión con la vacuola para la degradación 8,9,10. La fosforilación de receptores de pexofagia, como Atg36p en Saccharomyces cerevisiae y Atg30p en Pichia pastoris, es crítica para que los receptores recluten maquinaria central de autofagia y faciliten la orientación peroxisomal a los autofagosomas 8,11.

En las células de mamíferos, la pexofagia puede ser inducida por ubiquitinación. El marcado de las proteínas de membrana peroxisomal PMP34 o PEX3 con ubiquitina en el lado citosólico induce pexofagia12. La sobreexpresión de PEX3 induce la ubiquitinación de los peroxisomas y la eliminación de los peroxisomas por los lisosomas13. Además, la fusión de PEX5 con un EGFP C-terminal perjudica la exportación de PEX5 monoubiquitinado y da lugar a pexofagia14. Por otro lado, la pexofagia también puede ser desencadenada por el tratamiento conH2O2. Los peroxisomas producen especies reactivas de oxígeno (ROS); específicamente, la enzima peroxisomal Acox1, que cataliza el paso inicial de la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga (> 22 carbono), produce no solo acetil-CoA sino también ROS peroxisomal. En respuesta a los niveles elevados de ROS bajo el tratamiento conH2O2, las células de mamíferos activan la pexofagia para reducir la producción de ROS y aliviar el estrés. Se ha informado que el tratamiento conH2O2impulsa el reclutamiento de ataxia-telangiectasia mutada (ATM) a peroxisomas. ATM luego fosforila PEX5 para promover el recambio peroxisomal por pexofagia15.

Dado que los peroxisomas son centros generadores de ROS, también son propensos al daño de ROS. Las lesiones peroxisomales provocadas por ROS obligan a las células a activar la pexofagia para iniciar las vías de control de calidad del peroxisoma (eliminación del peroxisoma dañado por autofagia). Aquí, describimos un enfoque para el desencadenamiento a demanda de la lesión peroxisomal provocada por ROS. El protocolo aprovecha la producción de ROS activadas por luz dentro de los orgánulos 16,17,18,19,20 (Figura 1). Los peroxisomas marcados con colorante se iluminan, lo que lleva a la producción de ROS dentro de la luz peroxisomal, lo que desencadena específicamente la lesión peroxisomal. Usando este protocolo, se muestra que los peroxisomas estresados por ROS se eliminan a través de una vía de degradación dependiente de ubiquitina. Los peroxisomas estresados por ROS reclutan la ubiquitina E3 ligasa Stub1 para permitir su inmersión en autofagosomas para su eliminación individual por pexofagia16. Se puede usar este protocolo para comparar el destino de los peroxisomas lesionados y sanos dentro de la misma célula mediante microscopía de lapso de tiempo. El método también se puede utilizar para dañar globalmente todos los peroxisomas (en todas las células) en una placa de cultivo, lo que permite el análisis bioquímico de la vía de pexofagia.

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Protocolo

1. Preparación de células que expresan diKillerRed o proteínas automarcantes (SLP) en la luz del peroxisoma

  1. Siembra las células deseadas en placas de cultivo celular con fondo de vidrio. Para el experimento aquí, sembrar 2 x 105 células SHSY5Y humanas en 840 μL de medio de cultivo (DMEM / F-12 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina / estreptomicina) o 6 x 10 4 células NIH3T3de ratón en 840 μL de medio de cultivo (DMEM suplementado con 10% de suero bovino y 1% de penicilina/estreptomicina) en una placa de cultivo de 35 mm con un micropocillo de vidrio de 20 mm de diámetro.
    NOTA: El número de células sembradas debe ajustarse proporcionalmente de acuerdo con el área del micropocillo de vidrio cuando se utilizan platos con fondo de vidrio de otras especificaciones.
  2. Cultivar las células por debajo de 5% de CO2/37 °C durante 24 h.
  3. Transfectar las células con los plásmidos deseados utilizando un reactivo de transfección.
    1. Utilice PMP34-TagBFP para marcar los peroxisomas en células vivas. Utilice diKillerRed-VKSKL dirigido a peroxisomas o SLP-VKSKL (+ ligandos SLP marcados con colorante) para la generación de ROS en la luz del peroxisoma (a través de la producción de ROS activada por luz). En este protocolo, utilizamos la proteína autoetiquetante HaloTag-VKSKL21. Para monitorizar la translocación de Stub1/Hsp70, la acumulación de proteínas ubiquitinadas y la formación de autofagosomas en peroxisomas estresados por ROS, transfectar EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub o EGFP-LC3B, respectivamente. Para comprobar la generación de ROS en la luz peroxisomal, co-transfecte diKillerRed-VKSKL con la sonda redox fluorescente localizada en peroxisomas roGFP2-VKSKL22.
    2. Para la transfección de células SHSY5Y, diluir plásmidos en 55 μL de DMEM/F-12 sin suero y diluir 1 μL de reactivo de transfección en 55 μL de DMEM/F12 sin suero. Combine el ADN diluido con el reactivo diluido. Mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    3. Añadir el complejo al micropocillo de 20 mm previamente chapado con 100 μL de medio de cultivo para SHSY5Y sin antibióticos (DMEM/F-12 con 10% de suero fetal bovino). Agite suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás.
    4. Para la transfección celular NIH3T3, sustituya el DMEM/F-12 sin suero por un medio sérico reducido para diluir los plásmidos y el reactivo de transfección. Sustituir el medio de cultivo de recubrimiento por SHSY5Y por medio de cultivo para células NIH3T3 sin antibióticos (DMEM con 10% de suero bovino).
  4. Después de 2 h de transfección, retire el medio que contiene el reactivo de transfección y agregue 1 ml de medio de cultivo fresco. Incubar las células NIH3T3 o SHSY5Y a 37°C y 5% deCO2 durante 24 h.
    NOTA: También se pueden usar otras líneas celulares para estudiar la pexofagia mediada por Stub1 (por ejemplo, células HeLa).

2. Tinción de peroxisomas con ligandos SLP marcados con colorante (para la producción de ROS activadas por luz)

  1. A las 24 h después de la transfección, retirar el medio de cultivo y añadir 100 μL de ligando HaloTag TMR de 200 nM o 200 nM del ligando Janelia Fluor 646 HaloTag al micropocillo de vidrio de 20 mm.
    NOTA: Los ligandos SLP marcados con colorante deben diluirse con el medio de cultivo respectivo para cada línea celular. La elección de los ligandos marcados con Janelia Fluor 646 liberará los canales azul, verde y rojo para obtener imágenes de fluorescencia aguas abajo.
  2. Transfiera el plato a una incubadora de 37 ° C, 5% de CO2 . Mancha durante 1 h. Después de 1 h, retire bien el medio de tinción y agregue 1 ml de medio de cultivo fresco.

3. Estrés ROS de peroxisomas en un microscopio confocal de barrido láser

  1. Coloque un plato con fondo de vidrio que contenga las células deseadas en un microscopio confocal de escaneo láser equipado con una incubadora de etapa.
  2. Haga clic en Ventana de herramientas, elija Ocular y haga clic en el botón DIA (Figura 2A) para encender la luz transmitida. Vea el plato a través del ocular del microscopio y enfoque las células girando la perilla de enfoque.
  3. Elija LSM y haga clic en el botón Dye & Detector Select (Selección de tinte y detector ) (Figura 2B). Haga doble clic en los tintes deseados en la ventana emergente para seleccionar la configuración adecuada de láser y filtro para obtener imágenes de las células (Figura 2C). Haga clic en Livex4 en el panel Live para iniciar un escaneo láser rápido para comenzar a detectar las señales de fluorescencia de las células (Figura 2D).
  4. Mueva el escenario con el controlador del joystick y localice las células medianas que expresan diKillerRed-VKSKL o SLP-VKSKL para aplicar tensión ROS (en los peroxisomas). Adquirir una imagen de la célula deseada.
  5. Haga clic en Ventana de herramientas y elija Estimulación LSM (Figura 2E). Haga clic en el botón de elipse y, en la ventana de imagen en vivo, use el mouse para dibujar un ROI circular de 15 μm de diámetro (Figura 2F) que contenga los peroxisomas deseados adquiridos en el paso 3.4 a los que se aplicará tensión ROS (consulte la Figura 3 para ver un ejemplo).
  6. Para aplicar estrés ROS, use 561 nm para células con el ligando SLP marcado con diKillerRed-PTS1 o TMR, y use 640 nm para células teñidas con el ligando SLP marcado con Janelia Fluor 646.
  7. Seleccione la longitud de onda del láser para aplicar la tensión ROS. Introduzca el porcentaje de láser deseado y la duración (Figura 2G).
  8. Haga clic en Adquirir y haga clic en el botón Estimulación (Figura 2H) para iniciar el escaneo con luz de 561/640 nm a través de los ROI durante 30 s cada uno. Esto corresponde a un ajuste de potencia láser de ~ 5% para 561 nm y 640 nm en el microscopio confocal utilizado aquí. Esta operación conducirá a la producción de ROS en los peroxisomas.
    NOTA: Uno puede seleccionar ROI de diferentes tamaños. Uno debe ajustar proporcionalmente el tiempo de iluminación para cada ROI de acuerdo con su área.
  9. Después de 30 s de iluminación láser, los peroxisomas dentro de los ROI habrán perdido sus señales diKillerRed-PTS1 / TMR / Janelia Fluor 646. Esta pérdida de señal permite distinguir los peroxisomas iluminados de los no iluminados (dañados vs. sanos) dentro de una célula.

4. Monitorización de la pexofagia en células vivas mediante imágenes de lapso de tiempo

  1. Siga la translocación de Stub1, Hsp70, Ub, p62 o LC3B marcados con EGFP en los peroxisomas iluminados/estresados por ROS mediante imágenes de lapso de tiempo utilizando intervalos de 10 minutos entre fotogramas (para ejemplos, consulte las Figuras 3-7).
    NOTA: Las señales EGFP-Stub1 o EGFP-Hsp70 comienzan a aparecer 10-20 minutos después de la iluminación y permanecen en todos los peroxisomas dañados hasta ~ 40 minutos después de la iluminación. Las señales EGFP-Ub aparecen 30 minutos después de la iluminación y duran 2-3 h. La translocación EGFP-p62 aparece 60 minutos después de la iluminación, y las señales EGFP-LC3B se hacen visibles ~ 3 h después de la iluminación.
  2. Cuantifique las señales EGFP en los peroxisomas dañados (de Stub1, Ub, p62 o LC3B) utilizando ImageJ. Realice los pasos siguientes para usar ImageJ para cuantificar una imagen de tres canales (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. Abra la imagen y aplique selecciones elípticas o selecciones a mano alzada para encerrar la región que contiene todos los peroxisomas iluminados (señal positiva PMP34-TagBFP y señal de ligando HaloTag blanqueada; Figura 8A).
    2. Haga clic en Duplicar para seleccionar el canal PMP34-TagBFP (Figura 8A). Establezca un umbral usando el menú desplegable Imagen > Ajustar > umbral para marcar los peroxisomas (Figura 8B).
    3. Seleccione Analizar > Analizar partículas para determinar las regiones exactas de los peroxisomas iluminados. ImageJ registra estas regiones de interés (ROI) en el administrador de ROI (Figura 8C).
    4. Haga clic en Duplicar para seleccionar el canal EGFP para analizar la señal de fluorescencia de Ub, p62 o LC3B conjugada con EGFP (Figura 8D). Seleccione todos los ROI en el Administrador de ROI (Figura 8E).
    5. Aplicar medida en el ROI Manager para medir las señales de EGFP en los peroxisomas (Figura 8E). Encuentra el valor del área y la densidad integrada (la suma de todas las intensidades de píxeles) para cada ROI en la tabla Resultados (Figura 8E).
    6. Para obtener las intensidades medias de fluorescencia de EGFP en diferentes puntos de tiempo después de la iluminación, divida la intensidad de EGFP integrada por el área total de peroxisomas iluminados (PMP34-TagBFP señal positiva y áreas negativas de señal de ligando HaloTag). Para obtener la señal acumulada en los peroxisomas, reste la intensidad promediada en un punto de tiempo por la intensidad promediada en el tiempo = 0, y luego normalice por la intensidad promedio en el tiempo = 0.

5. Dañar globalmente todos los peroxisomas (en cada célula) en una placa de cultivo

  1. Realice el paso 1 (preparación de células que expresan diKillerRed dirigido a peroxisomas [diKillerRed-VKSKL] o SLP [SLP-VKSKL]) y el paso 2 (tinción de peroxisomas con el ligando SLP [para la producción de ROS activadas por luz]).
  2. Después de 1 h de tinción con ligando marcado con TMR, retire el medio de tinción y agregue 1 ml de medio de cultivo que contenga 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol; un inhibidor de la catalasa).
    NOTA: La catalasa es un eliminador de ROS expresado en la luz del peroxisoma, por lo que el tratamiento con 3-AT ayuda a aumentar el daño oxidativo provocado por la luz en los peroxisomas.
  3. Coloque la placa de cultivo sobre un LED (555-570 nm). Iluminar todas las celdas con una densidad de potencia de 1,8 W/cm2 durante 9 h en una incubadora.
    NOTA: Para realizar este paso fuera de una incubadora, coloque la placa de cultivo en una placa calefactora de 37 °C. Agregue 20 mM HEPES al medio que contiene 3-AT y cubra el plato de cultivo con una película transparente para minimizar el intercambio de gases. HEPES es un agente amortiguador que mantiene el pH fisiológico en cultivo celular fuera de una incubadora deCO2 durante la iluminación LED.
  4. Valide el éxito del daño provocado por LED mediante la obtención de imágenes de las señales EGFP-Ub, EGFP-p62 o EGFP-LC3B en los peroxisomas. Usando la condición de iluminación descrita anteriormente, el 82% de las células SHSY5Y que expresan de manera estable HaloTag-VKSKL mostraron pexofagia mediada por Stub1.
  5. Cosechar las células para el análisis bioquímico posterior.

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Resultados

El esquema de inducción de pexofagia mediado por Stub1 que se muestra aquí aprovecha la generación de ROS asistida por colorante dentro de la luz del peroxisoma. Esta operación requiere intensidades de luz mínimas. Por lo tanto, los peroxisomas que contienen proteínas o colorantes fluorescentes pueden iluminarse utilizando microscopios confocales estándar de barrido láser. La iluminación focal conduce a la producción instantánea y localizada de ROS dentro de los peroxisomas individuales, como lo indica el repo...

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Discusión

Este protocolo detalla cómo desencadenar la pexofagia mediada por Stub1 dentro de cultivos celulares elevando los niveles de ROS peroxisomales con luz. Como el protocolo se basa en la generación de ROS asistida por colorante, es necesario garantizar una expresión suficiente de diKillerRed-VKSKL o tinción de ligando SLP marcada con colorante dentro de las células de interés. Dado que diferentes tipos de células o células de diferentes antecedentes genéticos pueden albergar peroxisomas con propiedades ligeramente ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación MOST 111-2311-B-001-019-MY3 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell MatTekP35G-1.5-20-C20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)Sigma AldrichA8056
bovine serumThermoFisher Scientific16170060
Cell culture incubatorNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicamade by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia SinicaHsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicagenerated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicagenerated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
fetal bovine serumThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Inverted Confocal Microscope OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668transfection reagent
NIH3T3 cellATCCCRL-1658adherent
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850reduced serum media
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicagenerated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cellATCCCRL-2266adherent

Referencias

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  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
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  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
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  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).
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  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428(2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
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