Fluoro-respirometría de alta resolución del músculo esquelético equino

Resumen

Los caballos tienen una capacidad excepcional de ejercicio aeróbico, lo que hace que el músculo esquelético equino sea un tejido importante tanto para el estudio de la fisiología del ejercicio equino como para la fisiología mitocondrial de los mamíferos. Este artículo describe técnicas para la evaluación integral de la función mitocondrial en el músculo esquelético equino.

Resumen

La función mitocondrial (fosforilación oxidativa y generación de especies reactivas de oxígeno) es crítica tanto en la salud como en la enfermedad. Por lo tanto, la medición de la función mitocondrial es fundamental en la investigación biomédica. El músculo esquelético es una fuente robusta de mitocondrias, particularmente en animales con una capacidad aeróbica muy alta, como los caballos, lo que los convierte en sujetos ideales para estudiar la fisiología mitocondrial. Este artículo demuestra el uso de respirometría de alta resolución con fluorometría concurrente, con mitocondrias del músculo esquelético recién cosechadas, para cuantificar la capacidad de oxidar sustratos bajo diferentes estados mitocondriales y determinar las capacidades relativas de distintos elementos de la respiración mitocondrial. El éster metílico de tetrametilrodamina se utiliza para demostrar la producción del potencial de membrana mitocondrial resultante de la oxidación del sustrato, incluido el cálculo de la eficiencia relativa de las mitocondrias mediante el cálculo del potencial relativo de membrana generado por unidad de flujo de oxígeno concurrente. La conversión de ADP a ATP resulta en un cambio en la concentración de magnesio en la cámara de reacción, debido a las diferentes afinidades de los adenilatos para el magnesio. Por lo tanto, el verde de magnesio se puede utilizar para medir la tasa de síntesis de ATP, lo que permite el cálculo adicional de la eficiencia de la fosforilación oxidativa (relación entre la fosforilación y la oxidación [P / O]). Finalmente, el uso de Amplex UltraRed, que produce un producto fluorescente (resorufina) cuando se combina con peróxido de hidrógeno, permite la cuantificación de la producción de especies reactivas de oxígeno durante la respiración mitocondrial, así como la relación entre la producción de ROS y la respiración concurrente. Estas técnicas permiten la cuantificación robusta de la fisiología mitocondrial bajo una variedad de diferentes condiciones simuladas, arrojando así luz sobre la contribución de este componente celular crítico tanto a la salud como a la enfermedad.

Introducción

Las mitocondrias de las células eucariotas producen la mayor parte del ATP utilizado por las células para el trabajo y el mantenimiento¹. Un paso clave en la producción mitocondrial de ATP es la conversión de oxígeno en agua, y por lo tanto la capacidad metabólica de las mitocondrias y las células asociadas se cuantifica con frecuencia a través de la medición del consumo de oxígeno². Sin embargo, la fisiología mitocondrial es más compleja que el simple proceso de consumo de oxígeno, y la dependencia de este criterio de valoración proporciona exclusivamente una evaluación incompleta del impacto de la función mitocondrial y la disfunción en la salud celular. La caracterización completa de la función mitocondrial requiere la evaluación no solo del consumo de oxígeno, sino también de la producción de ATP y de especies reactivas de oxígeno (ROS).

Se pueden lograr medidas adicionales de las funciones mitocondriales clave simultáneamente con la medición de la respiración mediante el uso de fluoróforos específicos. El éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) es un fluoróforo catiónico que se acumula en la matriz mitocondrial en proporción al potencial de voltaje transmembrana mitocondrial, lo que resulta en una disminución de la intensidad fluorescente debido a esta acumulación³. TMRM se puede utilizar como un indicador de cambios relativos en el potencial de la membrana mitocondrial, o se puede utilizar para cuantificar cambios precisos en el voltaje transmembrana con experimentos adicionales para determinar constantes que permiten la conversión de la señal fluorescente a mV. El verde de magnesio (MgG) es un fluoróforo que emite fluorescencia cuando se une a Mg²⁺, y se utiliza para mediciones de la síntesis de ATP basadas en la afinidad diferencial de ADP y ATP para el catión divalente de magnesio⁴. Los investigadores deben determinar las constantes específicas de afinidad/disociación (Kd) tanto para ADP como para ATP bajo condiciones analíticas específicas para convertir los cambios en la fluorescencia de MgG en un cambio en la concentración de ATP. Amplex UltraRed (AmR) es el fluoróforo utilizado para medir la producción de peróxido de hidrógeno y otras ROS durante la respiración mitocondrial⁵. La reacción entre_H2O2y AmR (que es catalizada por la peroxidasa de rábano picante) produce resorufina, que es detectable a través de la fluorescencia a 530 nM. Cada uno de estos ensayos se puede agregar individualmente a los ensayos de respiración mitocondrial en tiempo real, para proporcionar mediciones concurrentes de los aspectos respectivos de la fisiología mitocondrial, proporcionando así un vínculo directo entre la respiración y la producción mitocondrial.

Los caballos son capaces de tasas muy altas de consumo de oxígeno específico de masa, debido en parte al alto contenido mitocondrial del músculo esquelético equino, lo que hace que este tejido sea muy relevante para estudiar la fisiología mitocondrial. Con el desarrollo de la respirometría de alta resolución, los estudios que utilizan esta nueva tecnología han ayudado a definir las contribuciones de las mitocondrias del músculo esquelético equino tanto a la notable capacidad de ejercicio de los caballos como a la fisiopatología de las enfermedades del músculo esquelético 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Los estudios de la función mitocondrial del músculo esquelético equino son particularmente ventajosos, ya que la obtención de grandes cantidades de este tejido no es terminal. Por lo tanto, los sujetos equinos no solo pueden proporcionar suficiente tejido para la caracterización completa de la función mitocondrial, sino que también sirven como controles longitudinales para estudios mecanicistas de alta calidad sobre la fisiología mitocondrial. Por esta razón, se han desarrollado ensayos adicionales para cuantificar el potencial de membrana mitocondrial, la síntesis de ATP y la producción de ROS que complementan la medición del consumo de oxígeno en este tejido, con el fin de proporcionar una caracterización más robusta de la fisiología mitocondrial en el músculo esquelético equino.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Oklahoma. En este estudio se utilizaron cuatro pura sangre (17,5 ± 1,3 años, 593 ± 45 kg) para generar los resultados representativos.

1. Obtención de una muestra de biopsia del músculo esquelético

1. Obtener biopsias del músculo esquelético (seguir la técnica estéril) del centro del músculo semitendinoso (u otro músculo de interés), utilizando una aguja de biopsia de 12 G University College Hospital (UCH) (ver Tabla de materiales) mientras está bajo sedación ligera, y usando anestesia local después de un informe previamente publicado¹¹.
2. Transfiera las muestras de biopsia inmediatamente a viales con una solución de medios de transporte de biopsia helada (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazol, 20 mM taurina, 50 mM K-MES, 0,5 mM ditiotritol, 6,56 mM MgCl ₂, 5,77 mM ATP y 15 mM fosfocreatina, ajustados a pH 7,1; ver Tabla de materiales). Transporte al laboratorio para su análisis.
   NOTA: Consulte Doerrier et ^al.15 para obtener instrucciones específicas sobre la preparación de los medios de transporte de biopsia.
3. Aísle las mitocondrias de las muestras de biopsia usando un kit comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). El tampón de almacenamiento final no debe contener sustratos como ADP, ATP y succinato, que forman parte del ensayo de respirometría.
4. Resuspender el pellet final de las mitocondrias aisladas utilizando 80 μL de medios de suspensión (225 mM de manitol, 75 mM de sacarosa y 1 mM de EGTA; ver Tabla de materiales) por 100 mg de músculo utilizado para el aislamiento de las mitocondrias.
5. Minimice el intervalo desde el momento del procedimiento de biopsia hasta el aislamiento de las mitocondrias, y mantenga las muestras a 0-4 °C durante los pasos de procesamiento hasta que se agreguen a los respirómetros de alta resolución.
   NOTA: Los estudios preliminares han encontrado que las suspensiones de mitocondrias aisladas comienzan a perder capacidad funcional después de aproximadamente 2 h cuando se mantienen a 0-4 ° C.

2. Configuración del respirómetro de alta resolución

1. Los respirómetros de alta resolución se utilizan para cuantificar la respiración mitocondrial y los procesos asociados. Utilice el programa de control de software proporcionado por el fabricante (consulte la Tabla de materiales) para controlar el respirómetro, calibrar los sensores y recopilar datos sin procesar. Analice las muestras por duplicado para cada condición de prueba.
   NOTA: En todos los casos, las titulaciones recomendadas y las concentraciones finales de reactivos descritas en este protocolo se basan en una cámara de respirometría de 2 ml.
2. Determine el flujo de O2 de fondo y el punto cero del sensor de_O2 cada 2-4 semanas a través de la valoración en serie de ditionita, siguiendo las instrucciones del fabricante. Conserve estas constantes de calibración para ensayos posteriores hasta que se repita la calibración.
   NOTA: A diferencia de los procedimientos publicados anteriormente utilizando fibras musculares permeabilizadas^11,12,13,16, en los que la hiperoxia (250-500 μM) es necesaria para evitar la limitación de la difusión de O2 a las mitocondrias^, las mitocondrias aisladas pueden evaluarse utilizando un rango de 50-200 μM ^O2. Esto se puede lograr simplemente permitiendo que el medio respiratorio se equilibre con el aire ambiente antes de agregar la suspensión mitocondrial (es decir, después de la calibración diaria de un solo punto). Del mismo modo, la reoxigenación de la cámara de respiración se puede lograr simplemente abriendo la cámara hasta que se haya disuelto suficiente oxígeno ambiental en el medio de respirometría para elevar la concentración de oxígeno al nivel deseado.
3. Llene las cámaras del respirómetro con medios libres de magnesio (0,5 mM EGTA, 60 mM K-lactobionato, 20 mM taurina, 10 mM KH₂PO₄, 20 mM HEPES, 110 mM sacarosa y 1 g/L de albúmina sérica bovina [BSA] esencialmente libre de ácidos grasos, ajustado a pH 7.1; ver Tabla de materiales).
   NOTA: Consulte Komlodi et ^al.17 para obtener instrucciones específicas sobre la preparación de los medios respiratorios.
   1. Ajuste la temperatura de incubación del instrumento a 38 °C para representar la temperatura basal del músculo esquelético equino, y ajuste la mezcla de los medios respiratorios a 800 rpm utilizando un agitador magnético girando en la parte inferior de la cámara del respirómetro.
   2. Apague la iluminación de la cámara para evitar interferencias con los sensores fluorescentes.
   3. Energize el electrodo de oxígeno con un voltaje de polarización de 800 mV y amplifique la señal resultante con un ajuste de ganancia de 1.
   4. Registre la concentración de oxígeno cada 2 s, calcule el flujo de oxígeno como la pendiente negativa de la medición de oxígeno durante los 40 s anteriores (20 puntos de datos) e informe como pmol x ^s-1 x ml de solución de incubación.
4. Calibre el sensor de oxígeno permitiendo que el medio se equilibre con el aire ambiente. Calcule la presión parcial de oxígeno de referencia, basándose en la presión barométrica medida por el respirómetro de alta resolución y la concentración estándar de oxígeno atmosférico.

3. Medición del potencial de membrana mitocondrial mediante TMRM

1. Utilice sensores fluorescentes "verdes" (longitud de onda dominante de 530 nm) para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración. Energizar los sensores a 400-500 mV; La señal resultante se amplifica con una ganancia de 1:1.000.
   NOTA: Los ajustes específicos deben optimizarse para instrumentos individuales para capturar la señal esperada dentro del rango lineal del sensor.
2. Añadir TMRM (4 μL de solución de 1 mM para una concentración final de 2 μM; ver Tabla de materiales) antes de la adición de mitocondrias.
3. Calibre la señal fluorescente utilizando una calibración simple de dos puntos de la señal fluorescente (voltaje) frente a la cantidad de fluoróforo agregado (mM), antes de la adición de las mitocondrias.
   NOTA: Utilice la función de calibración de señal fluorescente en el software de control de la máquina para calibrar esta señal. La señal bruta de la sonda fluorescente puede requerir 30 minutos o más para estabilizarse con el fin de registrar el segundo punto de la calibración.
4. Realizar la calibración final de la señal TMRM después de completar el protocolo de titulación de respirometría mediante la entrega de varias valoraciones de agente de desacoplamiento (cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona; 2 μL por titulación) hasta que no se observen aumentos adicionales en la señal fluorescente TMRM, lo que indica el colapso completo del potencial de la membrana mitocondrial (Figura 1).
   NOTA: Este valor de señal fluorescente se considera igual al potencial transmembrana de 0 mV y se utiliza como punto de referencia para los valores de potencial de membrana relativos registrados durante el protocolo de titulación de respirometría.

4. Medición de la producción de ATP utilizando verde de magnesio (MgG)

1. Utilice sensores fluorescentes "azules" (longitud de onda dominante de 465 nm) para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración. Energize estos sensores para instrumentos individuales para capturar la señal esperada dentro del rango lineal del sensor.
2. Realice la configuración química y la calibración de la señal fluorescente de MgG después de la adición de las mitocondrias, pero antes de la adición de cualquier sustrato. Agregue 8 μL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 2 mM a la cámara de respirometría para quelar cationes (particularmente Ca 2+) que competirían con Mg²⁺ para unirse a MgG, luego agregue 4 μL de 1 mM MgG (1.1 μM) a la cámara de respiración.
3. Calibrar la señal de fluorescencia bruta con valoraciones secuenciales de 10 x 2 μL de 100 mM MgCl 2, permitiendo 1 min entre valoraciones para la estabilización de la señal fluorescente (Figura 2).
   NOTA: Este proceso, que se completa fuera de línea después de completar el ensayo y utilizando plantillas proporcionadas por el fabricante de la máquina y el software asociado, produce una curva de segundo orden de concentración de magnesio a señal fluorescente (se espera r² > 0.98), que se utilizará con una cantidad conocida de ADP agregada a la cámara de respirometría y los valores de K_d previamente determinados para determinar la concentración correspondiente de ATP¹¹.
4. Determine la tasa de síntesis de ATP, que es la pendiente de la concentración de ATP a lo largo del tiempo a lo largo del protocolo (Figura 3).

5. Medición de la producción mitocondrial de ROS utilizando Amplex UltraRed (AmR)

1. Utilice sensores fluorescentes "verdes" (longitud de onda dominante de 530 nm) para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración. Energizar los sensores a 300-400 mV; La señal resultante se amplifica con una ganancia de 1:1.000. Optimice los ajustes específicos de instrumentos individuales para capturar la señal esperada dentro del rango lineal del sensor.
   NOTA: Si se utilizan medios respiratorios sin MgCl 2, se debe agregar (20-60 μL de 100 mM de MgCl 2 para producir 1-3 μM MgCl₂) antes de agregar reactivos para el ensayo AmR.
2. Realice la configuración química y la calibración inicial del ensayo AmR antes de la adición de las mitocondrias. Añadir 30 μmoles de DTPA (6 μL de solución de 5 mM) a los cationes quelatos que puedan interferir con la reacción, añadir superóxido dismutasa (2 μL de una solución madre de 5.000 U/ml para convertir aniones superóxido en_H2O2para una detección más completa de la generación reactiva de oxígeno), peroxidasa de rábano picante (5 μL de una solución madre de 500 U/ml), y Amplex UltraRed (2 μL de una solución madre de 10 mM) (consulte la Tabla de materiales) para producir 5 U/mL, 1 U/ml y 10 μM en la cámara de respirometría, respectivamente.
3. Deje que la señal fluorescente se estabilice, luego agregue 0.2 μmoles de peróxido de hidrógeno (5 μL de una solución de 40 μM hecha fresca diariamente) dos veces, aproximadamente con 5 minutos de diferencia.
   NOTA: La señal fluorescente antes y después de las dos valoraciones de H2O2 proporciona una curva de calibración lineal de tres puntos del sistema (se espera r² > 0,95), cuya pendiente refleja la capacidad de respuesta general del sistema al informar de la relación entre la señal fluorescente y la producción (o adición) de_H2O2. Utilice la función de calibración de señal fluorescente en el software de control de la máquina para calibrar esta señal.
4. Realizar calibraciones adicionales de dos puntos (5 μL de una solución de 40 μM hecha fresca diariamente) a lo largo del ensayo, para permitir el ajuste de la capacidad de respuesta del ensayo a medida que la química de la respirometría cambia a lo largo del ensayo, con el momento específico de estos puntos de calibración a discreción del investigador (Figura 4).

6. Medición de la respiración mitocondrial

1. Añadir 15 μL de suspensión mitocondrial aislada (paso 1.4) a cada cámara de incubación de 2 ml, de modo que los resultados representen el rendimiento mitocondrial de 18,75 mg de músculo. Selle la cámara de incubación. Vortex la muestra entre cada valoración para mantener una suspensión uniforme de la muestra.
2. Mida el consumo de oxígeno residual (ROX) antes de la adición de cualquier sustrato. Reste este valor (típicamente menos de 0,2 pmol O₂ x s-1 x ^mL-1) de los valores de consumo de oxígeno de cada paso en el protocolo de titulación de sustrato/desacoplador/inhibidor (SUIT)¹¹ después de completar el protocolo.
   NOTA: Es fundamental que las señales tanto del sensor de oxígeno como del sensor de fluorescencia se estabilicen durante al menos 1 minuto (según lo evaluado por la pendiente calculada estable de las señales del sensor primario), ya que el estado general de la respiración cambia por las valoraciones para obtener resultados fiables. Esto se aplica a todos los pasos de valoración.
3. Utilice un SUIT de propósito general que permita la caracterización inicial de la función mitocondrial del músculo esquelético equino. Comience con titulaciones secuenciales de piruvato (5 μL de solución acuosa 2 M), glutamato (10 μL de solución acuosa 2 M) y malato (10 μL de solución acuosa 0,4 M) (consulte la Tabla de materiales) en cada cámara para producir nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y estimular la respiración no fosforilante (fuga) apoyada por NADH oxidado a través del Complejo I (L_N) (Figura 1, Figura 3 y Figura 4).
4. Añadir ADP (20 μL de solución acuosa de 500 mM; ver Tabla de materiales) para estimular la respiración fosforilante a través del Complejo I (P_N).
5. Añadir succinato (20 μL de solución acuosa 1 M; ver Tabla de materiales) para producir respiración fosforilante a través de la combinación del Complejo I y el Complejo II (P_N+S).
   NOTA: Con la combinación de respiración a través del Complejo I y el Complejo II, el consumo de oxígeno puede ser lo suficientemente alto como para consumir la mayor parte del oxígeno disuelto en los medios de incubación. Si la concentración de O2 disminuye por debajo de 50 μM, reoxigenar los medios de incubación desprecintando la cámara de incubación hasta que la concentración de O2 medida haya aumentado por encima de 150 μM. Repita este paso según sea necesario para mantener suficiente_O2 para la respiración mitocondrial.
6. Agregue rotenona (2 μL de solución de etanol 0.1 mM; consulte la Tabla de materiales) para bloquear el Complejo I. El flujo de oxígeno resultante representa la capacidad del Complejo II para apoyar el consumo de oxígeno mitocondrial a través de la oxidación del succinato solo (P_S).
   PRECAUCIÓN: La rotenona es una sustancia venenosa. Use seguridad estándar de laboratorio y evite la ingestión o inhalación.
7. Calcular el valor medio para una condición experimental dada a través de cámaras de respirometría individuales que contienen alícuotas de una sola biopsia.
   NOTA: Los cálculos derivados, como las relaciones de control de flujo (FCR), son valiosos para identificar cambios relativos en diferentes vías, e incluyen fuga de FCR (L N / P N), FCR N (P _N / P N + S) y_{FCR S} (P S / P_{N + S}). La eficiencia de fosforilación oxidativa calculada (1-L_N/P_N+S) proporciona una estimación del impacto general de la respiración con fugas ajustada por la capacidad respiratoria total.

Resultados

El estado de referencia propuesto es el de un pura sangre sedentario sano (sin aumento de la condición física debido al ejercicio obligatorio) y una muestra de músculo fresco recolectada del centro de un músculo postural, que contiene un alto porcentaje de fibras musculares esqueléticas tipo I ricas en mitocondrias e incubadas en condiciones que se aproximan al metabolismo en reposo (es decir, 38 ° C y pH 7.0). En estas condiciones, el investigador puede esperar valores de L N de 2.71 ± 0.90, valores de...

Discusión

La adición de señales fluorescentes a la salida estándar del respirómetro de alta resolución proporciona información valiosa sobre la fisiología mitocondrial, pero la calibración meticulosa de la señal fluorescente es fundamental para los datos de calidad. Los protocolos originales para el uso de MgG sugieren que las curvas de calibración generadas al calcular las constantes de disociación magnesio-adenilato podrían aplicarse a ensayos posteriores⁴; sin embargo, la señal fluorescente ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A5285
Amplex UltraRed	Life Technologies	A36006
ATP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A2383
BSA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A6003
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	C4830
CCCP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	C2759
DatLab 7.0	Oroboros Inc		Software to operate O2K fluororespirometer
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	D0632
DTPA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	D1133
EGTA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	E4378
Glutamate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	G1626
HEPES	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	H7523
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P8250
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	516813	Must be made fresh daily prior to assay
Imidazole	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	I2399
K-MES	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M8250
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M9272
Magnesium Green	Thermo Fisher Scientific	M3733
Malate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M1000
Mannitol	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M9647
Mitochondrial isolation kit	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	MITOISO1
O2K fluororespirometer	Oroboros Inc		Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.
Phosphocreatine	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P7936
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P1767
Potassium lactobionate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	L2398
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P0662
Pyruvate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P2256	Must be made fresh daily prior to assay
Rotenone	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	R8875
Succinate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	84097
Superoxide dismutase	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	S8160
Taurine	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	T0625
Titration pump	Oroboros Inc
Titration syringes	Oroboros Inc
TMRM	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	T5428
UCH biopsy needle	Millenium Surgical Corp	72-238067	Available in a range of sizes