Neuromodulación ultrasónica focalizada de cultivos neuronales humanos in vitro en matrices de microelectrodos multipocillos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el uso de un sistema de alto rendimiento que permite el monitoreo y la cuantificación de los efectos neuromoduladores de los ultrasonidos focalizados en neuronas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSC).

Resumen

Los efectos neuromoduladores de los ultrasonidos focalizados (FUS) se han demostrado en modelos animales, y el FUS se ha utilizado con éxito para tratar trastornos psiquiátricos y del movimiento en humanos. Sin embargo, a pesar del éxito de la FUS, el mecanismo que subyace a sus efectos sobre las neuronas sigue siendo poco conocido, lo que dificulta la optimización del tratamiento mediante el ajuste de los parámetros de la FUS. Para abordar esta brecha en el conocimiento, estudiamos neuronas humanas in vitro utilizando neuronas cultivadas a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSC). El uso de HiPSCs permite el estudio de comportamientos neuronales específicos del ser humano tanto en estados fisiológicos como patológicos. En este informe se presenta un protocolo para el uso de un sistema de alto rendimiento que permite la monitorización y cuantificación de los efectos neuromoduladores de la FUS en las neuronas HiPSC. Mediante la variación de los parámetros de FUS y la manipulación de las neuronas HiPSC a través de modificaciones farmacéuticas y genéticas, los investigadores pueden evaluar las respuestas neuronales y dilucidar los efectos neuromoduladores de FUS en las neuronas HiPSC. Esta investigación podría tener implicaciones significativas para el desarrollo de terapias seguras y efectivas basadas en FUS para una variedad de trastornos neurológicos y psiquiátricos.

Introducción

El ultrasonido focalizado (FUS) es una modalidad de neuromodulación prometedora que permite la estimulación no invasiva a profundidades centimétricas con una resolución submilimétrica ^1,2,3. A pesar de estas fortalezas, el impacto clínico del FUS es limitado, en parte debido a la falta de conocimiento sobre su mecanismo de acción. Sin una base teórica sólida, los investigadores y los médicos se enfrentan a dificultades para adaptar la terapia para satisfacer las necesidades específicas de los pacientes individuales en diferentes condiciones. Una teoría prominente propuesta por Yoo et ^al.4 sugiere que los canales iónicos mecanosensibles son responsables de la activación neuronal. Sin embargo, esta teoría no explica la activación de FUS en las neuronas cerebrales humanas, que carecen de^{estos canales}. Esta ambigüedad limita la utilización de la FUS en la clínica, ya que impide el ajuste de los parámetros de la FUS para optimizar los resultados del tratamiento.

Estudios previos relacionados han empleado una variedad de enfoques para investigar los mecanismos fisiológicos que sustentan la FUS y para determinar los parámetros óptimos de estimulación. Un paso crucial en este proceso implica el monitoreo de las respuestas neuronales como retroalimentación, lo que se puede lograr a través de métodos que involucran el monitoreo de la puerta de iones, como la imagen de iones de calcio⁴, la imagen óptica¹ y el registro electrofisiológico ex vivo (por ejemplo, electromiografía⁶ o electrofisiología piel-nervio⁷). Sin embargo, la mayoría de estos estudios utilizan neuronas no humanas o enfoques in vivo, que pueden introducir variaciones adicionales debido a controles subóptimos. Por el contrario, el uso de electrodos para medir las señales neuronales en neuronas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSC) in vitro ofrece mediciones más sensibles y un mayor control sobre el entorno experimental. En este trabajo, se ha desarrollado un sistema in vitro utilizando matrices de microelectrodos (MEAs) para medir las respuestas eléctricas de las neuronas HiPSC después de la estimulación de FUS, como se muestra en la Figura 1. Este sistema permite a los investigadores de la comunidad monitorear las respuestas neuronales al variar los parámetros de ultrasonido (por ejemplo, frecuencia, longitud de ráfaga, intensidad). Además, este sistema permite un alto nivel de control de la sensibilidad neuronal a los estímulos físicos (p. ej., temperatura, presión y cavitación)^8,9, ya que la funcionalidad de los canales iónicos de las neuronas puede manipularse genética y farmacológicamente (p. ej., utilizando gadolinio para inhibir los canales iónicos)10,11,12. Este control a nivel molecular puede ayudar a dilucidar los mecanismos detrás de los efectos neuromoduladores de la FUS.

Protocolo

1. Preparación de materiales

1. Aspire el medio de cultivo y utilícelo para llenar un solo pocillo en una placa de cultivo de neuronas de 24 pocillos con MEA incrustado (Figura 2A). Cultivar e inducir las neuronas siguiendo el protocolo publicado por Taga et ^al.13.
2. Esterilizar la interfaz del parafilm, la banda elástica y el cono FUS con su membrana de goma utilizando etanol al 70% durante 10 min, y colocarlos en la campana extractora para su posterior montaje.
3. Desgasificar 300 mL de agua desionizada y 50 mL de gel de acoplamiento. Centrifugar el agua y el gel a 160 x g durante 5 min para evitar inducir cavitación dentro del medio de acoplamiento.
   NOTA: La fuente original de las HiPSC proviene de las líneas celulares GM01582 y CIPS. En promedio, se puede lograr una densidad de 5 x 10⁴ neuronas motoras y 2,5 x 10⁴ astrocitos por pocillo¹⁴.

2. Conexión y configuración de los periféricos

1. Fije el cono FUS al transductor con tornillos y selle el cono con una membrana de goma flexible en una campana estéril ventilada. Llene el cono con el agua desgasificada y desionizada (DG-DI) del paso 1.3 y asegúrese de que no haya burbujas en el cono para evitar la cavitación.
2. Utilice una varilla roscada personalizada para fijar el soporte impreso en 3D a un marco (Figura 2B). Coloque el marco de manera que la cabeza del transductor FUS esté sobre el pocillo que se estimulará.
3. Use una banda elástica para asegurar la parapelícula sobre el pocillo en la placa MEA de 24 pocillos que contiene el medio y las HiPSC.
4. Prepare el sistema FUS conectando la electrónica del controlador del transductor de ultrasonido, en este caso, la salida de potencia del transductor (TPO; Figura 3A), a una toma de corriente de 100-240 V (Figura 3B, Conexión 6) y conectando la red correspondiente al TPO y al transductor FUS (Figura 3B, Conexión 1 y Conexión 2, respectivamente). La red correspondiente garantiza un acoplamiento eléctrico eficiente entre el transductor y el TPO.
5. Conecte el sistema MEA a una toma de corriente (100-240 V) (Figura 3B, Conexión 5). Conecte el puerto de sincronización del sistema MEA al TPO (Figura 3B, Conexión 3). Esta conexión sincronizará la adquisición de datos por parte del sistema MEA con la estimulación FUS.
6. Coloque la placa MEA de 24 pocillos en el sistema MEA y retire la tapa para permitir el contacto directo entre el transductor y el pocillo. Coloque el transductor 5-10 mm por encima de la placa del pocillo para dejar espacio para el gel de acoplamiento desgasificado, como se describe en el paso 3.2 (Figura 3A y Figura 2B).

3. Estimulación y adquisición de señales neuronales

1. Configure los parámetros FUS en el panel de control TPO (Tabla 1).
2. Aplique el gel de acoplamiento en la parte superior del parafilm y baje el transductor FUS en el gel de acoplamiento, asegurando el contacto con el gel con un mínimo de burbujas de aire (Figura 2A).
3. Inicie la grabación del sistema MEA haciendo clic en el botón Inicio de la interfaz de usuario.
4. Inicie la sonicación FUS pulsando el botón inferior derecho del TPO (Figura 3A, Etiqueta 7), y espere al menos 5 minutos entre cada ronda de sonicación para permitir que las neuronas vuelvan a un estado basal.
5. Utilice el pulso de disparo generado por el sistema FUS para alinear la secuencia de estimulación FUS con el registro MEA (Figura 3B, Conexión 3).

4. Procesamiento y análisis de datos

1. Transfiera los datos del sistema MEA a la computadora mediante una conexión USB (Figura 3B, Conexión 4). Para empezar, haz clic en el panel Configuración del experimento . A continuación, elija el tipo de datos que desea registrar. En este caso, se recomiendan las espigas crudas. Finalmente, asigne un nombre al archivo y seleccione la ubicación deseada dentro de la unidad de disco para completar la transferencia.
   NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar ejecutando el script de Python publicado en https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod.
2. Lea los datos de cada uno de los 16 electrodos.
3. Aplique un filtro de paso de banda Butterworth con un ancho de banda de 5 Hz a 3 kHz con un orden de Butterworth de 8.
   NOTA: Para optimizar estos valores, es crucial tener en cuenta la velocidad de disparo de las celdas específicas y el número de celdas involucradas. Al multiplicar estos 2 valores, se puede estimar la tasa de disparo general de la población celular en el experimento.
4. Aplique un filtro gaussiano con σ = 3 para suavizar la señal.
   NOTA: El parámetro podría optimizarse en función de los valores recomendados del sistema MEA, ya que un suavizado excesivo puede provocar una distorsión de los datos después de la adquisición, y un suavizado insuficiente introduciría ruido no deseado.
5. Establezca un umbral para detectar los picos potenciales como 5 veces la desviación estándar de la señal suavizada gaussiana.
6. Calcule la velocidad de disparo dividiendo el número de picos registrados en una ventana de 50 ms en los 16 canales por la longitud de la ventana (es decir, 50 ms). Desplace la ventana a lo largo de la señal al siguiente fotograma y repita el cálculo de la velocidad de disparo (Figura complementaria 1).
7. Analice la señal leyendo el tiempo de sonicación de la FUS a partir de los datos transferidos en función del cambio en la velocidad de disparo asociada a la FUS.

5. Limpieza y reutilización de placas MEA de pocillos múltiples

1. Una vez finalizados los experimentos, utilice una pipeta para retirar con cuidado el medio de los pocillos de la placa de pocillos múltiples, teniendo cuidado de evitar la superficie del electrodo.
2. Agregue 2 mL de agua DG-DI por pozo. Aspire y repita una vez.
3. Para desalojar las células y los residuos, añadir a la placa una mezcla de 1 g de detergente enzimático Terg-A-Zyme con 10 ml de agua DG-DI estéril (0,3 ml por pocillo). Déjalo incubar durante la noche a temperatura ambiente (RT).
4. Al día siguiente, retire la solución de los pocillos y enjuáguelos con 1 ml de agua estéril DG-DI.
5. Incubar la placa de pocillos múltiples durante 5-7 minutos y aspirar. Repita este paso 5 veces.
6. Agregue 0.5 mL de agua estéril DG-Di por pocillo. Registre la línea de base de la placa de pocillos múltiples limpia para validar que la placa MEA esté limpia. Una placa limpia debe exhibir patrones de ruido gaussiano con valores de intensidad bajos.
7. Guarde la placa de pocillos múltiples limpia a 4 °C hasta que esté lista para ser utilizada de nuevo. Cambie el agua en la que se almacenan los MEA al menos una vez al mes.

Resultados

En resumen, presentamos un protocolo que permite monitorizar in vitro la neuromodulación de FUS utilizando neuronas cultivadas a partir de HiPSCs. En la Figura 1 se describe la plataforma general del sistema para estimular las neuronas inducidas por HiPSC y registrar las respuestas eléctricas correspondientes para su análisis. Este estudio se centra en la estimulación FUS de las neuronas y el registro de las respuestas eléctricas en un sistema MEA, como se muestra en la Figura 2. En la Figura 3 se ilustran los componentes periféricos de los sistemas FUS y MEA y sus conexiones.

La caracterización del punto focal se realiza antes de los experimentos neuronales para asegurar que el fondo del pozo esté completamente cubierto por el punto focal FUS. La visualización del punto focal en las láminas termocrómicas, como se muestra en la Figura 4, debe realizarse para evaluar el sistema FUS. Después de la caracterización del punto focal, se deben realizar los pasos de posprocesamiento, incluido el filtrado, el umbral y el cálculo de la velocidad de disparo, que se resumen en la Figura 5 y la Figura 6. Estos pasos son esenciales para recuperar señales útiles filtrando el ruido del entorno y, por lo tanto, para obtener información sobre los cambios en la actividad neuronal causados por FUS. Los gráficos ráster de la Figura 6A-B muestran los picos detectados en cada canal. Como todo el fondo del pozo está dentro del punto focal del transductor FUS, se espera que el FUS altere la velocidad de disparo en todos los electrodos. Este cambio en la tasa de disparo se visualiza en el gráfico de velocidad de disparo que se muestra en la Figura 6C, que muestra que los parámetros de estimulación elegidos dieron como resultado un aumento en la tasa de disparo neuronal. Específicamente, la velocidad de disparo pre-FUS (es decir, la línea de base) fue de 140 Hz ± 116,7 Hz, mientras que la velocidad de disparo posterior a FUS fue de 786 Hz ± 419,4 Hz con FUS de onda continua. Además, la Figura 6C muestra cómo la alteración de los parámetros de FUS (por ejemplo, el uso de FUS de onda pulsada en lugar de onda continua) puede alterar la magnitud del cambio en la velocidad de disparo, así como cambiar la cantidad de tiempo antes de que las neuronas regresen a su estado de referencia. El ultrasonido focalizado de baja intensidad (LIFU) no causa un calentamiento significativo de los cultivos, especialmente cuando se compara con el ultrasonido focalizado de alta intensidad, que pretende lograr una lesión térmica. La falta de cambios de temperatura clínicamente impactantes está respaldada por cálculos teóricos y simulaciones (Figura complementaria 2). Incluso en casos extremos de los parámetros experimentales de FUS enumerados en la Tabla 1, solo se pudo observar un aumento mínimo de la temperatura de aproximadamente 0,04 °C.

El uso de un gráfico de velocidad de disparo permite cuantificar los efectos neuromoduladores de la FUS y se puede utilizar para diferenciar entre respuestas excitatorias e inhibidoras. Una ventaja significativa de la placa MEA multipocillos es que se puede reutilizar varias veces para estudiar diferentes estados neuronales y parámetros de estimulación de una manera de alto rendimiento.

Figura 1: Visión general de la plataforma in vitro para la neuromodulación por ultrasonido focalizado (FUS) de neuronas en un pocillo y la medición de su actividad neuronal mediante una matriz de microelectrodos. Cada electrodo (líneas rojas, verdes y azules) registra a partir de una población de neuronas dentro de un solo pocillo. Se implementa una tubería de procesamiento para convertir las grabaciones eléctricas neuronales en bruto en la detección de patrones de disparo neuronal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Neuromodulación FUS con una matriz de microelectrodos multipocillos (MEA). (A) Esquema de la configuración para la neuromodulación FUS con un MEA multipocillo. Las ondas acústicas generadas por el transductor FUS se propagan a través de un cono FUS lleno de agua desgasificada y se acoplan mediante gel de ultrasonidos. El parafilm se fija al pozo mediante una banda elástica para evitar la contaminación. La placa MEA envía registros eléctricos desde las neuronas al sistema MEA. (B) Una fotografía del transductor FUS en la placa de pocillos múltiples contenida en el sistema MEA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Configuración de la plataforma in vitro . (A) La parte frontal de la configuración de la plataforma in vitro . La salida de potencia del transductor (TPO; izquierda) se utiliza para programar los parámetros FUS. El sistema MEA (derecha) registra la actividad eléctrica de las neuronas en la placa del pocillo, que son neuromoduladas por el transductor FUS. (B) La parte posterior de la configuración de la plataforma in vitro con conexiones de la red correspondiente (1) al TPO y (2) al transductor. (3) La conexión del sistema MEA al TPO sincroniza la adquisición de datos. (4) La conexión del sistema MEA a la computadora para la transferencia de datos. (5) La conexión de alimentación al sistema MEA. (6) La conexión de alimentación al sistema FUS. (7) El botón de sonicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Caracterización del transductor FUS. (A) Un mapa de presión del punto focal utilizando los parámetros FUS detallados en la Tabla 1 medidos por el sistema AMPLITUDE¹⁵. (B) Pre y postsonicación de una lámina termocrómica colocada en el fondo de un pozo utilizando la configuración experimental que se muestra en la Figura 3. La lámina termocrómica cambia de color en respuesta a los cambios de temperatura, lo que proporciona una validación visual de la estimulación exitosa en la ubicación de las neuronas. La intensidad media máxima del pulso de pico espacial (I_SPPA) de 30 W/^cm2 y la sonicación continua de 3 min se ajustaron para cambiar drásticamente la temperatura local y así visualizar mejor dicho punto focal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Canalización de procesamiento. Paso 1: Las grabaciones eléctricas sin procesar se capturan a partir de N = 16 canales. Los pasos futuros muestran el proceso utilizando el canal 16 (resaltado en rojo). Paso 2: Para cada canal, se aplica un filtro de paso de banda Butterworth (paso de banda de 5 Hz a 3 kHz), seguido de un filtro gaussiano (σ = 3). Se establece un umbral de cinco veces la desviación estándar de la señal dentro de una ventana de 2 s centrada al inicio de la sonicación. Paso 3: Las señales por encima o por debajo del umbral se caracterizan como picos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Gráficos ráster y de velocidad de disparo. (A) Gráfico ráster de los picos detectados en cada canal en función del tiempo de sonicación. El tiempo de estimulación de la FUS se anota con una línea roja. (B) Diagrama ráster de neuronas bajo diferentes configuraciones de FUS con FUS continuo para comparación. (C) La cadencia de disparo se calculó utilizando una ventana deslizante de 50 ms. Las tasas medias de disparo antes y después de las neuromodulaciones de la FUS fueron de 140 Hz y 786 Hz, respectivamente. Con FUS pulsada, las velocidades medias de disparo fueron de 230 Hz y 540 Hz. Se observó que una activación más corta y un menor cambio de velocidad fueron inducidos por este conjunto de estimulación variable de FUS. El proceso para calcular la velocidad de disparo se detalla en la Figura 1 suplementaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetro	Valor
Potencia máxima/Ch.	1.200 W
Preal	0,749 W/canal.
YoSPPA	10,79 W/cm2
ISPTA	0,05 W/cm2
Longitud de ráfaga	0,100 ms
Frecuencia	250.00 kHz
Centro de atención	39.800 milímetros
Periodo	20.000 ms
Temporizador	60.000 s

Tabla 1: Parámetros de ultrasonido focalizado (FUS) establecidos en el TPO para el estudio presentado en la Figura 4.

Figura 1 suplementaria: Procesamiento desde el trazado ráster hasta la velocidad de disparo. Paso 1: Cuente los picos entre todos los canales para obtener el número de conteo dentro de una ventana deslizante determinada. Nota: Aquí, se eligió una ventana deslizante más grande (establecida en 0,1 s) para una mejor ilustración. Paso 2: Convierta los picos por longitud de ventana en picos por segundo (por ejemplo, aquí, multiplique los recuentos por 10 para convertirlos a hercios [Hz], y luego divida por 1,000 para obtener el valor en kilohercios [kHz]). Paso 3: La curva de velocidad de disparo adquirida como resultado. Un kit de herramientas de código abierto, junto con datos muestreados, está disponible en GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Perfil de temperatura del resultado de la simulación de onda K de LIFU¹⁶. Sobre la base del mapa de intensidad acústica que se muestra en la Figura 4, el resultado de la simulación de la onda K sugiere un aumento máximo de la temperatura de 0,04 °C dentro de la región central de la zona focal (radio: 2 mm) utilizando el caso extremo de los parámetros experimentales de FUS enumerados en la Tabla 1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este manuscrito describe un método novedoso que se puede utilizar para registrar la actividad neuronal en las HiPSC durante la neuromodulación de la FUS. Este protocolo es generalizable a diferentes transductores FUS y sistemas MEA. Para replicar los resultados observados con el protocolo descrito, el investigador debe asegurarse de que el punto focal del transductor sea mayor que el área del fondo del pocillo MEA. Además, si se utilizan diferentes líneas celulares neuronales, los parámetros del filtro deben ajustarse a la respuesta de frecuencia esperada para las células dentro del pocillo. Si no se pueden lograr resultados representativos, se debe considerar la modificación de los parámetros antes mencionados (por ejemplo, la longitud de la ráfaga, la intensidad, el ciclo de trabajo, etc.).

Aunque este trabajo demostró un aumento en la tasa de disparo después de la estimulación de FUS, se deben recopilar más datos para demostrar la repetibilidad de este hallazgo antes de sacar conclusiones. Este protocolo hereda las limitaciones de los sistemas MEA, que suelen tener debilidades derivadas del registro de la señal de corriente directa del microelectrodo. Aunque el contacto directo con la neurona proporciona una mejor sensibilidad, puede alterar la célula y afectar la precisión de la medición. Además, debido al pequeño tamaño de los pocillos, nuestro sistema no incluye tejido periférico, que también puede desempeñar un papel en la neuromodulación¹⁷. Esto puede limitar la aplicabilidad de las conclusiones extraídas de esta configuración a entornos in vivo . Para estudiar respuestas de red más complejas, debe diseñarse un sistema MEA de mayor densidad de canales para mejorar su sensibilidad¹⁸. Se han identificado varias direcciones futuras para este sistema propuesto, incluido el uso de un pórtico 3D para sujetar el transductor y garantizar una colocación precisa¹⁹. Se podrían realizar mejoras adicionales con respecto al algoritmo de posprocesamiento, incluida la utilización de un algoritmo de clasificación de picos²⁰ para clasificar neuronas individuales. Este proceso sería beneficioso para desentrañar las respuestas de las neuronas multiunidad en futuros estudios sobre los mecanismos de FUS. Lo más importante es incorporar modalidades adicionales de estimulación, como estímulos químicos, eléctricos y ópticos, para dilucidar los mecanismos subyacentes. Estos métodos pueden alterar las propiedades y comportamientos neuronales, por ejemplo, mediante la inhibición de canales iónicos específicos¹⁵ o la modificación de las características de la membrana²¹. Al modular los factores principales dentro de la vía de señalización hipotética, los investigadores pueden identificar las contribuciones de cada factor en entornos controlados y, en última instancia, arrojar luz sobre las complejas interacciones en juego.

La estimulación eléctrica²² es una de las técnicas más consolidadas para la neuromodulación, con una larga historia de aplicaciones exitosas en entornos clínicos y de investigación. Por el contrario, la FUS y la optogenética²³ son modalidades relativamente nuevas que han ganado atención en los últimos años. Las principales ventajas de la FUS son su carácter no invasivo y su capacidad para estimular las neuronas a profundidades que pueden ser difíciles de alcanzar con otras técnicas, como la estimulación eléctrica y la optogenética. Sin embargo, al igual que la optogenética²⁴, la FUS tiene algunas limitaciones relacionadas con el modelado de la propagación de la onda y las respuestas neuronales asociadas. Capturar la complejidad de las propiedades acústicas heterogéneas de los tejidos in vivo puede ser un desafío, lo que conduce a incertidumbres en el campo de presión y, en consecuencia, en las respuestas neuronales. Esta dificultad para modelar con precisión estas propiedades presenta un desafío a la hora de optimizar la técnica para aplicaciones específicas del mundo real. Las complejidades inherentes enfatizan la importancia de los sistemas in vitro como el de este estudio, ya que permiten el estudio directo de las respuestas en condiciones de intensidad acústica controlada.

En conclusión, este sistema proporciona una plataforma in vitro de alto rendimiento para estudiar los efectos neuromoduladores de FUS en las neuronas humanas. Con este sistema, se pueden explorar los mecanismos de acción de la FUS midiendo las respuestas eléctricas de las neuronas humanas cuando se exponen a diferentes niveles y tipos de estimulación en un entorno controlado. Por lo tanto, ofrece una valiosa herramienta complementaria a los modelos humanos y animales comúnmente utilizados en el campo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEA System	Axion Biosystem Inc.	Maestro Edge	Sampling Rate: 11500 Hz
MEA Plate	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells
Well plate Interface	Amcor Inc.	Parafilm PM996; P7793	Thickness: 127 µm
CO2 Tank and Regulator for culture	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC	Concentration: 5%
Culture Media	ThermoFisher Inc.	Laminin; 23017-015	Concentration: 1 µg/mL
HiPSC Neurons	Peprotech	CIPS and GM01582 Derived; 450-10	Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13)
Transducer	Sonic Concepts Inc.	CTX250; 008	Center Frequency: 250 kHz
Matching Network	Sonic Concepts Inc.	CTX250; NFS102v2	Impedance: 50 Ω
Transducer Power Output (TPO)	Sonic Concepts Inc.	Version 4.1; 020	Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz
Membrane	McMaster Inc.	Silicone Rubber; 5542N115	Thickness: 0.0127 cm
Coupling Gel	Parker Laboratory Inc.	Aquasonic 100; B08DDWG GXB	Viscosity: 130,000–185,000 cops
Connection to Probe holder	McMaster Inc.	Steal Threaded Rod; 90322A661	Length: 1–1/2" Long
Centrifuge	ThermoFisher Inc.	Sorvall Legend X1R; 75004261	Max acceleration: 10–25,830 x g
Hydrophone	Sonic Concepts Inc.	Y-104; 009	Range: 50 kHz–1.9 MHz
Water Tank	Sonic Concepts Inc.	WT	Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Water Conditioning Unit	Sonic Concepts Inc.	WCU; SN006	Flow Velocity: 50 mL/s maximum
Oscilloscope	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Sampling rate: Up to 50 MHz
Stage	Sonic Concepts Inc.	MicroStage; 2	Accuracy: 1 µm
Thermochromic sheet	TIPTEMP Inc.	Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337	Range: 22–24 °C
Computer	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4: 3.7 GHz
Data Transfer Software	Mathworks Inc.	MATLAB	Version 2021b
Processing Software	Python Software Foundation	Python	Version 3.7.10