Aislamiento y cultivo de macrófagos sinoviales primarios y fibroblastos a partir de tejido murino de artritis

Resumen

El presente estudio proporciona un protocolo modificado para aislar macrófagos sinoviales y fibroblastos del tejido de artritis inflamatoria murina.

Resumen

La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune que provoca una inflamación crónica de las articulaciones. Los macrófagos sinoviales y los fibroblastos sinoviales tienen un papel central en la patogénesis de la artritis reumatoide. Es importante comprender las funciones de ambas poblaciones celulares para revelar los mecanismos subyacentes a la progresión patológica y la remisión en la artritis inflamatoria. En general, las condiciones experimentales in vitro deben imitar el entorno in vivo tanto como sea posible. Las células derivadas de tejidos primarios se han utilizado en experimentos que caracterizan los fibroblastos sinoviales en la artritis. Por el contrario, en experimentos que investigan las funciones biológicas de los macrófagos en la artritis inflamatoria, se han utilizado líneas celulares, macrófagos derivados de la médula ósea y macrófagos derivados de monocitos sanguíneos. Sin embargo, no está claro si estos macrófagos reflejan realmente las funciones de los macrófagos residentes en los tejidos. Para obtener macrófagos residentes, se modificaron los protocolos anteriores para aislar y expandir tanto los macrófagos primarios como los fibroblastos del tejido sinovial en un modelo de ratón con artritis inflamatoria. Estas células sinoviales primarias pueden ser útiles para el análisis in vitro de la artritis inflamatoria.

Introducción

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por hiperplasia de la membrana sinovial, que conduce a la destrucción articular ^1,2. Los macrófagos y fibroblastos residentes en los tejidos están presentes en la membrana sinovial sana para mantener la homeostasis articular. En los pacientes con AR, los fibroblastos sinoviales (SF) proliferan y las células inmunitarias, incluidos los monocitos, se infiltran en la membrana sinovial y en el líquido articular, procesos asociados a la inflamación ^1,3,4.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentos con Animales de la Universidad de Ehime y se realizaron de acuerdo con las Directrices de la Universidad de Ehime para Experimentos con Animales (37A1-1*16).

1. Preparación de instrumentos, reactivos y medios de cultivo

1. Prepare el medio de cultivo de la siguiente manera: complemente el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y una solución antibiótica-antimicótica al 1% (anti-anti).
2. Preparar el medio de digestión de la siguiente manera: complementar el medio de cultivo con 1 mg/ml de cola....

Discusión

Este método desarrollado aquí mejora las técnicas anteriores para aislar tanto los SF de la artritis murina como los macrófagos residentes de varios órganos ^7,11. El método modificado puede aislar tanto macrófagos como fibroblastos de la membrana sinovial inflamatoria con alta pureza, y es simple y reproducible. Dado que el método no requiere instrumentos complejos como un clasificador de células, cualquiera puede realizarlo. Además, la presente técnic.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution	nacalai tesque	35556-44	Diluted with HBSS
Antibiotic–antimycotic (anti/anti)	Gibco	15240-062
Butterfly needle	TERUMO	SV-23DLK	23G
Cell strainer	Falcon	352340	40 µm pore, Nylon
Cellmatrix Type I-C	Nitta gelatin	637-00773	Type I-C collagen
Centriguge tube 15	TPP	91014	15 mL tube
Centriguge tube 50	TPP	91050	50 mL tube
Collagenase from C. Histolyticum	Sigma	C5138	Type IV collagenase
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)	Gibco	10569-010
Fetal bovine serum (FBS)	SIGAM	173012	Heat inactivation was performed
Hanks' balanced salt solution (HBSS)	Wako	085-09355
Scissors	Bio Research Center	PRI28-1525A
Tissue culture dish 40	TPP	93040	For cell culture
Tissue culture dish 60	TPP	92006	For cell culture
Tweezers	KFI	1-9749-31	Fine-point
Tweezers	Bio Research Center	PRI28-1522	Serrated tip
ZEISS Stemi 305	ZEISS	STEMI305-EDU	Stereomicroscope