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Resumen

Aquí mostramos cómo procesar núcleos de árboles con una cadena de herramientas de tomografía computarizada de rayos X. A excepción de la extracción química para algunos fines, no se necesita ningún tratamiento físico de laboratorio adicional. La cadena de herramientas se puede utilizar para estimaciones de biomasa, para obtener datos MXD/ancho de anillo de árbol, así como para obtener datos cuantitativos de anatomía de la madera.

Resumen

Se presenta una cadena de herramientas de tomografía computarizada (TC) de rayos X para obtener el ancho del anillo del árbol (TRW), la densidad máxima de la madera tardía (MXD), otros parámetros de densidad y datos cuantitativos de la anatomía de la madera (QWA) sin la necesidad de un tratamiento de superficie intensivo en mano de obra ni ninguna preparación de muestra física. En este caso, la atención se centra en los núcleos de incremento y los procedimientos de escaneo con resoluciones que van desde 60 μm hasta 4 μm. Se definen tres escalas en las que se debe observar la madera: (i) escala entre anillos, (ii) escala de anillos, es decir, análisis de anillos de árboles y escala de densitometría, así como (iii) escala anatómica, esta última acercándose a la calidad convencional de sección delgada. Los portamuestras diseñados a medida para cada una de estas básculas permiten el escaneo de alto rendimiento de múltiples núcleos de incremento. Se desarrollaron específicamente una serie de rutinas de software para tratar de manera eficiente las imágenes de TC de rayos X tridimensionales de los núcleos de los árboles para TRW y densitometría. En este trabajo se explican brevemente los principios básicos de la TC, necesarios para una correcta comprensión del protocolo. Se presenta el protocolo para algunas especies conocidas que se utilizan habitualmente en dendrocronología. La combinación de estimaciones aproximadas de densidad, datos TRW y MXD, así como datos cuantitativos de anatomía, nos permite ampliar y profundizar los análisis actuales para las reconstrucciones climáticas o la respuesta de los árboles, así como desarrollar aún más el campo de la dendroecología/climatología y la arqueología.

Introducción

La densidad de la madera es una variable fácil de medir1 que refleja las propiedades anatómicas y químicas de la madera2. En las estimaciones de biomasa aérea, la densidad de la madera es una variable de peso importante 3,4,5, que se multiplica por las dimensiones del árbol y un factor que representa el contenido de carbono de la madera. La densidad de la madera está estrechamente ligada a las propiedades mecánicas de la madera6 y refleja la historia de vida de un árbol7.

La densidad de la pared celular se mide en aproximadamente 1500 kg/m³ y se considera bastante constante8, sin embargo, también se deben considerar las variaciones de la densidad de la pared celular dentro del anillo 8,9. Las células leñosas (en general, las traqueidas de las coníferas, los vasos, el parénquima y las fibras de las maderas duras) están orientadas/moldeadas de diferentes maneras y el grosor de la pared celular y el tamaño del lumen de estas células varían10. Por lo tanto, la densidad de la madera varía entre los árboles, dentro de un árbol (axial y transversal) y dentro de intervalos cortos dentro de un anillo de árbol11,12. En muchos casos, la variación de la densidad de la madera en la escala de anillo también delimita el límite del anillo del árbol13. La densidad de la madera y, en última instancia, las fracciones de tejido se generan y, en este artículo, se clasifican en tres categorías (es decir, tres escalas de resolución diferentes), según el objetivo del estudio (Figura 1), como se describe a continuación.

Escala entre anillos: Al medir piezas de madera, se obtiene un único valor para esa muestra. Esto se puede hacer a través de la inmersión en agua o geométricamente14. De esta manera, se pueden obtener variables tecnológicas generales de la biomasa o de la madera. Para incluir la variación de la médula a la corteza, estas piezas de madera pueden dividirse a su vez en bloques que se miden manualmente para obtener información sobre la estrategia de historia de vida15. Al cambiar a la TC de rayos X de baja resolución, como en los escáneres médicos17,18, los datos de TRW en anillos de tamaño medio a ancho se pueden obtener de manera eficiente en muchas muestras 18,19,20. Esta es también la escala que se puede utilizar para evaluar la biomasa desde la médula hasta la corteza de árboles templados y tropicales 4,22, que suele oscilar entre 50 μm y 200 μm.

Escala de anillo: La madera es un registrador de las condiciones ambientales pasadas. El parámetro más conocido es el ancho de los anillos de los árboles (TRW), pero para las reconstrucciones de la temperatura global, se ha demostrado que los registros de densidad máxima de madera tardía (MXD) son un mejor indicador de la temperatura22. MXD es una variable fácil de medir23, y un indicador del grosor de la pared celular y el tamaño de las células en las últimas células de un anillo de árbol, y se encuentran en la línea de árboles y los sitios boreales relacionados positivamente con la temperatura del aire estacional24: cuanto más cálidos y largos son los veranos, más lignificación de la pared celular se produce, lo que aumenta la densidad de estas últimas células. Las mediciones tradicionales, como la inmersión y la geometría, son menos precisas para determinar esta densidad a nivel de anillo. Un trabajo anterior desarrolló una cadena de herramientas para el uso de película de rayos X en muestras de corte fino25. Esto provocó una revolución tanto en la silvicultura como en la paleoclimatología posterior15,18, definiendo la densidad máxima de la madera tardía (MXD), es decir, el valor de la densidad máxima a menudo al final de un anillo, como un indicador de la temperatura de verano. El principio básico es que las muestras se aserran (aproximadamente de 1,2 mm a 7 mm13) para que queden perfectamente paralelas a la dirección axial, y la muestra se coloca en una película sensible expuesta a una fuente de rayos X. A continuación, estas películas radiográficas se leen a través de una fuente de luz que detecta la intensidad y guarda los perfiles y los parámetros anuales de los anillos de los árboles. Estas herramientas, sin embargo, requieren una cantidad significativa de preparación de muestras y trabajo manual. Recientemente, esto se ha desarrollado para la TC de rayos X de una manera más estandarizada o basada en núcleos montados26. La resolución aquí oscila entre 10 μm y 20 μm. TRW también se mide en esta escala, especialmente cuando se trata de anillos más pequeños.

Escala anatómica: A esta escala (resolución < 4 μm), los niveles de densidad promedio se vuelven menos relevantes a medida que se visualizan las principales características anatómicas y se pueden medir su ancho y proporciones. Por lo general, esto se hace mediante la realización de microsecciones o exploraciones ópticas de alta resolución o exploraciones μ-CT. Cuando es necesario visualizar la ultraestructura de las paredes celulares, la microscopía electrónica de barrido es el método más utilizado27. A escala anatómica, las fracciones individuales de tejido se hacen visibles para que los parámetros fisiológicos puedan derivarse de las imágenes. Sobre la base de los parámetros anatómicos individuales y la densidad de la pared celular de la madera, se puede derivar la densidad anatómica para compararla con los estimadores convencionales de la densidad de la madera24.

Debido a las técnicas de corte mejoradas y al software de imagen29,30, se ha desarrollado dendro-anatomy30 para tener un registro más preciso de la madera, tanto para tener una estimación más cercana de la MXD en coníferas como para medir varias variables anatómicas de árboles de hoja ancha. En esta escala, se miden los parámetros anatómicos reales y se relacionan con los parámetros ambientales31 . Con μCT también se puede obtener este nivel32,33.

Dado que la madera es inherentemente higroscópica y anisotrópica, la densidad de la madera debe definirse cuidadosamente y especificarse las condiciones de medición, ya sea seca en horno, acondicionada (normalmente con un contenido de humedad del 12%) o verde (talada en el bosque)34. Para muestras grandes y fines técnicos, la densidad de la madera se define como el peso dividido por su volumen en condiciones dadas. Sin embargo, el valor de la densidad de la madera depende en gran medida de la escala a la que se mide, por ejemplo, desde la médula hasta la corteza, la densidad de la madera puede duplicarse, y en una escala de anillo (en coníferas) la transición de la madera temprana a la madera tardía también da como resultado un aumento significativo en la densidad de la madera, con un pico en el límite del anillo.

Aquí, se presenta un protocolo de escaneo por TC de rayos X de núcleos incrementales con el fin de medir las características en las 3 escalas mencionadas anteriormente (Figura 1). Los desarrollos recientes en la TC de rayos X pueden cubrir la mayoría de estas escalas, debido a una configuración flexible. Los objetivos de la investigación determinarán el protocolo final para la exploración.

Un factor limitante crucial (que está inherentemente conectado a la naturaleza escamosa de la densidad de la madera y de la madera en general) es la resolución y el tiempo necesarios para el escaneo. Los ejemplos demuestran cómo: (i) obtener perfiles de densidad de madera a escala de árbol entre anillos para estimaciones de biomasa en Terminalia superba de la cuenca del Congo, (ii) obtener registros de densidad de cedro de Clanwilliam (Widdringtonia cedarbergensis) basados en escaneo helicoidal en un sistema HECTOR35, y (iii) medir los parámetros de la vasija en roble sésil, en el sistema Nanowood. Ambos escáneres forman parte del conjunto de escáneres del Centro de Tomografía de Rayos X de la Universidad de Nueva York (UGCT, por sus siglas en inglés)

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Figura 1: Árbol de decisión metodológico general para la tomografía computarizada de rayos X. Las filas indican los pasos a seguir, desde el objetivo de la investigación hasta el formato final de los datos. Las cajas blancas son los pasos que son relevantes para esta cadena de herramientas. Las cajas atenuadas son pasos que se pueden realizar con otro software o paquetes R, como dplr47 y Treeclim48 para el análisis de anillos de árboles, y ROXAS44 , así como ImageJ42 u otras aplicaciones (comerciales) para derivar parámetros anatómicos de la madera basados en las imágenes de TC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Investigación X-CT en madera
Configuración de un escáner: Un escáner de tomografía computarizada de rayos X estándar consta de un tubo de rayos X, un detector de rayos X, una etapa de rotación y un conjunto de motores para mover la etapa de rotación y, en la mayoría de los casos, también el detector, hacia adelante y hacia atrás (Figura 2).

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Figura 2. El sistema de escaneo HÉCTOR. El sistema35, que muestra la distancia del detector de fuente (SDD) y la distancia del objeto de la fuente (SOD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La mayoría de los sistemas de laboratorio tienen una geometría de haz cónico, lo que significa que los rayos X producidos se distribuyen desde la ventana de salida del tubo en forma de haz cónico, lo que implica que al cambiar la distancia entre el objeto y el tubo (SOD = Fuente-Objeto-Distancia) y el detector y el tubo (SDD = Fuente-Detector-Distancia), se controla el aumento (consulte la discusión sobre la resolución). Debido al poder de penetración de los rayos X, atraviesan el objeto, y la intensidad del haz de atenuación es una función de la energía del haz de rayos X, la composición química del objeto (el número atómico de los elementos presentes) y la densidad del material. Dado un espectro de energía constante y una composición constante del material de la madera, la atenuación del haz de rayos X depende en gran medida de la densidad del material, lo que explica su uso para la densitometría. La atenuación (o transmisión) puede expresarse mediante la ley de Beer-Lambert:

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con I0 el haz de rayos X entrante exponencialmente que decae en un haz de rayos X transmitido Id cuando se propaga a través del material a una distancia d. El coeficiente de atenuación lineal μ depende de una serie de interacciones con el material del objeto. Por lo tanto, las proyecciones son registros del haz transmitido.

Prácticamente, el objeto se monta en la etapa de rotación, se seleccionan un SOD y un SDD adecuados, también se selecciona una cierta potencia (relacionada con el tamaño, la densidad y la composición del objeto) y el objeto se gira 360° y durante esa rotación se toman múltiples proyecciones. Estas proyecciones se utilizan para reconstruir la estructura interior del objeto. Existen varios algoritmos de reconstrucción disponibles, de los cuales los más utilizados siguen basándose en el marco analítico desarrollado hace décadas, basándose en la transformación del radón y el teorema del corte de Fourier. Para más detalles, se remite al lector a la literatura especializada36.

Enigma de la resolución, el volumen de datos y el tamaño de la muestra: La resolución es clave en la tomografía computarizada de rayos X. En los sistemas con geometría inversa, o geometría de haz paralelo, como las líneas de luz de sincrotrón, otras consideraciones juegan un papel importante. Este protocolo solo analiza la tomografía computarizada de rayos X estándar en laboratorio con geometría de haz cónico. Aquí, el concepto de ampliación, tamaño de píxel del detector y tamaño de punto son esenciales. El aumento se define como la relación SDD/SOD. A continuación, el tamaño de píxel del detector obviamente también afecta a la resolución: cuanto menor es el tamaño de píxel, mayor es la resolución, pero en la mayoría de los casos el campo de visión (FoV) también está directamente relacionado con el tamaño de píxel y el tamaño del detector (menor tamaño de píxel, menor FoV para el mismo número de píxeles). Además, el tamaño del haz de rayos X también es importante: cuanto mayor sea el tamaño del punto, menor será la resolución, lo que significa que se pueden ver menos detalles.

Es importante tener en cuenta que se puede obtener una resolución superior a la posible según los límites mencionados anteriormente, por lo que es mejor utilizar el término tamaño de vóxel (un vóxel es un píxel de volumen) en lugar de resolución. Además, hay otros factores en juego, como la nitidez del detector, que limitan aún más la resolución real a la que se escanea un objeto. Solo una verdadera calibración del sistema, utilizando objetivos establecidos, proporciona la respuesta verdadera.

Sin embargo, en la mayoría de los casos, el tamaño del vóxel en el que se puede escanear un objeto está limitado principalmente por el tamaño del objeto. Esto significa que cuanto más grande sea el objeto, menor será el tamaño del vóxel. Si el objeto no cabe dentro del campo de visión del detector para un cierto tamaño de vóxel, entonces el tamaño del vóxel se puede reducir, por ejemplo, limitando el aumento.

Es importante tener en cuenta el tiempo de escaneo y el volumen de datos a la hora de decidir el tamaño de vóxel deseado. En general, cuanto menor sea el tamaño del vóxel, mayor será el detalle que se desea ver, cuanto más pequeña sea la muestra o menos muestras se puedan escanear a la vez, se requiere más tiempo y se recopilarán mayores volúmenes de datos. Imaginemos el siguiente ejemplo teórico: se puede escanear una muestra de 10 cm x 10 cm x 10 cm a 50 μm de una sola vez con un determinado sistema de TAC de rayos X y se desea escanear ese mismo volumen a 10 μm, el volumen que cabe dentro del campo de visión sería solo de 2 cm x 2 cm x 2 cm, asumiendo que esto es físicamente posible. Esto significa que se necesitan 125 escaneos (5³ = 5 veces mayor resolución, escala a la potencia de 3 debido a la naturaleza volumétrica de la técnica de imagen) para cubrir todo el volumen, y que el volumen de datos aumentaría igualmente. Por supuesto, esto es solo un experimento mental, y uno necesita considerar mucho más que solo la resolución. Para obtener más información, se remite al lector a una descripción general de las posibilidades de escaneo37.

Flexibilidad de los instrumentos para el escaneo de objetos de madera: En la última década, muchas empresas han suministrado sistemas de TC de rayos X con un montaje similar al HECTOR35. En38 se ofrece una visión general de varios sistemas de TC, especialmente evaluados por su resolución temporal.

En general, la flexibilidad y la facilidad de uso de los sistemas de TC de rayos X han mejorado considerablemente. Muchos sistemas permiten el escaneo de una amplia gama de objetos, lo que también es el caso de los sistemas de UGCT. El siguiente protocolo se muestra para el sistema HÉCTOR, que es adecuado para el análisis de anillos de árboles. Sin embargo, el protocolo es válido para cualquier otro sistema disponible si la resolución y el formato de los datos lo permiten.

Estos sistemas permiten el escaneo de una variedad de objetos. En la Figura 3 se muestran algunas imágenes de diferentes objetos de madera escaneados con el sistema HÉCTOR. Es esta flexibilidad la que comprende las tres escalas que presentamos en la Figura 1, que van desde una resolución gruesa hasta una resolución muy fina.

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Figura 3. Ejemplos de configuración de escaneo. (A) Un tronco, (B) un violonchelo49, (C) portamuestras (tipo 1) con núcleos de árbol para el escaneo por lotes y (D) portamuestras tipo 2 con núcleos de incremento para el escaneo helicoidal montados en la etapa de rotación de HECTOR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

1. Muestreo de núcleos

  1. Pruebe el árbol con un barrenador Pressler. Consulte referencias sobre cómo extraer el núcleo de un árbol manualmente39. Esta cadena de herramientas se presenta para núcleos de 5,15 mm.
  2. Coloque los corazones de los árboles sin pegar en pajitas de papel de 6 mm o en cualquier otro receptor que no requiera pegamento. No pegue los núcleos de los árboles en un soporte de madera. Si los núcleos ya estaban montados, desmóntelos con bisturí/sierra o disolvente, según el tipo de pegamento.
  3. Evite envolverlos en tubos de plástico, trate de secarlos primero para evitar el crecimiento de moho y la descomposición de hongos.
  4. Usa lápiz para escribir en las pajitas de papel, ya que la extracción podría desvanecer las escrituras con marcador.
    NOTA: Esta cadena de herramientas también es adecuada para núcleos de 4 mm. Se pueden utilizar núcleos ya montados y lijados, pero primero hay que desmontarlos. En el caso de la madera arqueológica o remanente, es necesario obtener una muestra del tamaño del núcleo (aserrando/reduciendo el tamaño) para escanearla.

2. Preparación del núcleo antes del escaneo

  1. Realice una extracción de etanol/tolueno o etanol o acetona40 Soxhlet durante al menos 24 h (Figura 4A,B). Esto es necesario para garantizar un volumen de madera libre de resina para tener un cálculo de densidad preciso (la resina atenúa la señal, Figura 4C13,41).
    1. Prepare una solución de 1000 mL de etanol con 427 mL de tolueno (según, por ejemplo, ASTM D 1107 - 96) o etanol puro o acetona. Muchas universidades tienen un taller de vidrio de laboratorio que puede hacer una versión adaptada del aparato Soxhlet para núcleos de árboles (Figura 4B).
    2. Llene el matraz de fondo redondo con el solvente y coloque las muestras dentro de las pajuelas en un soporte de acero inoxidable en el aparato Soxhlet con enfriador en un calentador de laboratorio. Permita al menos 6 sifones por hora.
      NOTA: Se utiliza preferiblemente un circuito cerrado de agua para la refrigeración (o cualquier otro sistema de refrigeración moderno). En este caso, una bomba de agua hace circular el agua, almacenada en un recipiente de 100 L con pastillas de cloro (para evitar el desarrollo de algas), a 120 L/h (pero esto dependerá del tamaño del aparato Soxhlet, así como del calor aplicado por el elemento calor). Se utiliza un enfriador de aire para enfriar el agua en el recipiente de 100 L. Para ahorrar en solvente, se pueden usar perlas de vidrio para llenar el volumen vacío del aparato Soxhlet.
    3. Compruebe regularmente la temperatura y el número de sifones. Seque los núcleos bajo una cubierta química (consulte la política del laboratorio para esto) para eliminar los residuos de solvente o coloque un horno de secado debajo de la cubierta química.
  2. Secar los núcleos durante 24 h en un horno de secado (103,5 °C) con ventilación de extracción y realizar un baño de agua caliente (90 °C) o una extracción Soxhlet con agua caliente durante 24 h como se ha descrito anteriormente.
    1. Mantenga las muestras en las pajitas de papel en los portamuestras de acero. Secar de nuevo en horno seco durante 24 h a 103,5 °C, luego acondicionar a 60% de humedad relativa (HR) antes de escanear.
      NOTA: En este caso, se elige el valor del 60% porque estas son aproximadamente las condiciones de humedad relativa promedio ambiental en la sala de exploración de tomografía computarizada de rayos X. También se pueden utilizar muestras secas al horno. El factor más importante es que todas las muestras se escanean en las mismas condiciones.
    2. En caso de que la extracción de agua degenere las pajitas de papel, vuelva a colocar los corazones de los árboles en nuevas pajitas de papel de 6 mm21. Tanto los núcleos de 5,15 mm como los de 4 mm se pueden colocar en pajitas de papel de 6 mm.
    3. Asegúrate de que toda la pajita de papel esté llena de madera. Envuelve ambos extremos de la pajita y corta los extremos. Esto permite una fácil inserción de las pajitas en el soporte cilíndrico.
    4. Asegúrese de que el lado del cambium (corteza) esté claramente indicado en el núcleo porque CoreProcessor y RingIndicator suponen que el lado de la corteza está hacia abajo. Retire las brocas y piezas, así como los núcleos con grietas, ya que es difícil trabajar con ellos.

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Figura 4. Flujo de trabajo para extraer y secar núcleos antes del escaneo. (A) Los núcleos de incremento en pajitas de papel se colocan primero en un baño de agua caliente y luego en una mezcla caliente de etanol y tolueno con un aparato Soxhlet durante 24 horas, luego se secan, se colocan en un baño de agua caliente durante 24 horas, luego se secan nuevamente a 103,5 ° C, luego se acondicionan antes del escaneo. (B) Imágenes de la instalación Soxhlet adaptada en la Universidad de Gante. Múltiples aparatos Soxhlet adaptados están conectados en serie. Tenga en cuenta el papel de aluminio y los tubos aislantes para mantener el solvente o la mezcla de solventes lo suficientemente caliente para la extracción. (C) Ejemplo de la superficie de un núcleo de incremento de Pinus longaeva antes y después de la extracción. Las resinas y otros extractivos enmascaran la señal de densidad real, debido a la atenuación de los rayos X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Escaneo de núcleos

  1. Seleccione el tipo de portamuestras adecuado (Figura 5) como se describe a continuación, según el propósito de la investigación como se describe en la Figura 1.
    1. Para fines de escala entre anillos, use el tipo de soporte 1: cartón y espuma floral perforada.
    2. Para el MXD data use el soporte tipo 2: un soporte de muestra de plástico que contiene 6 núcleos de 1-15 cm de longitud y tiene un diámetro de 3 cm.
    3. Utilice el soporte tipo 3: para fines de dendroanatomía, consiste simplemente en atar pajitas de papel.
  2. Cargue los núcleos de los árboles en pajitas de papel en el portamuestras y rellene la plantilla de hoja de cálculo que se puede descargar en https://dendrochronomics.ugent.be/#software. Cada número corresponde a una posición determinada en el portamuestras.
  3. Exploración en una instalación de μCT de rayos X: consulte a un experto en TC de rayos X para conocer la configuración y el protocolo de exploración adecuados. Para el escáner utilizado en este protocolo, consulte37.
  4. Reconstrucción de las imágenes escaneadas: consulte a un experto en tomografía computarizada de rayos X para conocer los ajustes adecuados de la reconstrucción, o los ajustes que vienen con el escáner de tomografía computarizada (paquete de software del escáner de tomografía computarizada de rayos X). Para conocer los parámetros de reconstrucción de este protocolo, véase37.

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Figura 5. Tipos de portamuestras y resolución. Diseño de los tres tipos principales de soportes, que corresponden a (A) escala entre anillos, (B) escala de anillos de árboles y (C) escala anatómica. Debido al tamaño resultante, el número de muestras disminuye con el aumento de los requisitos de resolución. Las representaciones 3D correspondientes para (D) escala entre anillos (soporte 1), (E) ancho de anillo y MXD (tipo de soporte 2) y (F) parámetros anatómicos (tipo de soporte 3). Barra de escala = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Obtener datos de TRW, datos de densidad y datos anatómicos

  1. Primeros pasos con el software.
    1. Para obtener los valores de densidad (tipo de soporte 1 y 2), instale los tres paquetes de software siguientes: (i) CoreProcessor, (ii) RingIndicator y (iii) CoreComparison toolboxes de
    2. Dado que estas cajas de herramientas se crearon en MATLAB, instale el tiempo de ejecución del compilador de MATLAB (MCR) correcto, disponible en: http://nl.mathworks.com/products/compiler/mcr/. La versión necesaria actualmente es MATLAB2022B. El MCR es gratuito, al igual que los 3 paquetes de software.
    3. Junto a la carpeta de los volúmenes reconstruidos, cree una nueva carpeta vacía para los archivos MAT (un formato de archivo de MATLAB que almacena variables, etcetera.), por ejemplo, matfiles_useful_name_sample_holder, esto es necesario para almacenar parámetros temporales.
    4. Asegúrese de que la hoja de cálculo esté en la carpeta de los volúmenes reconstruidos, para completar las muestras en un paso posterior.
  2. Preprocesamiento de los volúmenes principales con CoreProcessor.
    NOTA: Para datos de anatomía de alta resolución, no es necesario seguir los siguientes pasos de procesamiento (Figura 1), una vez que los volúmenes reconstruidos estén disponibles, consulte las directrices de ImageJ para imágenes 3D42. La segmentación se puede realizar a través del plugin Weka43 por ejemplo, para indicar los recipientes en rebanadas individuales12, o en plugins de software como ROXAS44.
    1. Preparación de la extracción de núcleos: Prepare la extracción automatizada de los núcleos de incremento (dependiendo de la escala entre anillos Figura 6A o de la escala entre anillos Figura 6B) como se describe a continuación.
      1. Seleccione la carpeta con los archivos reconstruidos (segmentos TIFF de sección transversal de 16 bits) y el archivo de hoja de cálculo (XrayForm.xlsx).
      2. Seleccione la carpeta vacía de 4.1.3. Esta es la carpeta donde CoreProcessor creará un archivo MAT que se utilizará en 4.2.2. para la extracción masiva de núcleos.
      3. Seleccione la carpeta de archivos MAT vacía recién creada o, si no se ha creado, seleccione cualquier otra carpeta. Se carga el volumen y aparece una sección transversal longitudinal del cilindro, verifique algunas rodajas horizontales para asegurarse de que todos los núcleos y referencias se montaron correctamente en el cilindro.
      4. Haga clic de abajo hacia arriba para seleccionar segmentos y evaluarlo. Estas secciones transversales se utilizarán para el siguiente paso, así que haga clic en toda la longitud. Indique las referencias oscuras (aire) y blancas (Figura 6), tantas veces como se indique en el archivo de la hoja de cálculo. Haga doble clic después de cada selección.
      5. Para el portamuestras 1, inspeccione la multipantalla con 9 secciones transversales, generadas a través del material de referencia para verificar si el cálculo de la densidad se realizó en la madera (y no en el papel pajizo u otro material no maderero). Esto es esencial para la correcta conversión a los valores reales de densidad de la madera.
      6. En una nueva ventana emergente, seleccione cada núcleo por separado dibujando un círculo/elipse a su alrededor. Realice el etiquetado en función de la información del archivo de la hoja de cálculo, verifique si el nombre es correcto. Respeta el orden en el que se rellena la plantilla. Toda la información se almacena en un archivo MAT, que se utilizará durante el siguiente paso para extraer todos los núcleos a la vez.
    2. Haga clic en Extracción masiva de núcleos para realizar la extracción de núcleos de todos los núcleos de un cilindro determinado (que se indicaron en 4.2.1.2), dado que los archivos de metadatos y hojas de cálculo se encuentran en la misma carpeta.
      NOTA: Cuando se utiliza la extracción masiva de núcleos, todos los núcleos se extraerán de acuerdo con el etiquetado del usuario (que se almacenan en la carpeta de archivos mat). Como resultado de esta operación, se creará una nueva carpeta llamada Extract que contiene todos los núcleos separados. Cuando se preparan varios portamuestras en el primer paso y todos los archivos MAT se almacenan en la misma carpeta, se procesarán todos los archivos MAT de esta carpeta.
    3. En la caja de herramientas CoreProcessor, haga clic en Corrección manual de Tg y, a continuación, seleccione la carpeta Extraída para garantizar la orientación adecuada del plano transversal y radial de cada volumen de núcleo, de forma similar al montaje de muestras físicas en un portamuestras antes de lijar manteniendo el plano transversal a la vista (Figura 7B).
      1. Algunas secciones transversales se muestran para que el usuario pueda ver la dirección del grano. En el último gráfico (abajo a la derecha), inspeccione la rebanada que se presenta y dibuje una línea para indicar la dirección del grano. Haga doble clic para rotar automáticamente el núcleo.
      2. Luego aparece una pantalla, aquí recorte el volumen del núcleo (Figura 7C), asegurándose de que el rectángulo abarque todo el diámetro del núcleo. Esto es necesario porque el punto central del rectángulo debe estar lo más cerca posible del eje central (para una correcta alineación en el módulo RingIndicator).
        NOTA: Si escanea a alta resolución, seleccione solo el material dentro del núcleo en esta etapa y use el convertidor para cambiar al soporte de muestras tipo 2. Esto es ciertamente útil para las especies de poros anulares, por ejemplo.
    4. Realice los siguientes pasos opcionales en caso de núcleos desalineados, volteados o rotos o formatos de imagen incompatibles.
      1. Corrección de la inclinación del núcleo (solo para el portamuestras 1): Para corregir automáticamente la inclinación del núcleo (por ejemplo, cuando el núcleo está ligeramente inclinado en el cilindro; Figura 7A). Esto es importante para los pasos posteriores. Seleccione la carpeta Extraída creada en el paso anterior.
        NOTA: Normalmente, esto no es necesario si tiene un soporte de muestras tipo 2 o tipo 3 (Figura 5) o cuando todas las muestras y los soportes de muestras están colocados perfectamente en posición vertical.
      2. Voltear volcadores: En caso de que la muestra no se haya colocado con el lado de la corteza hacia abajo (la dirección de la corteza de médula no es de izquierda a derecha), cambie la dirección volteando los núcleos. La función solicita una carpeta y creará una nueva carpeta.
      3. Pegar núcleos: Cose grandes partes de núcleos individuales de forma virtual. La idea no es coser perfectamente, sino asegurarse de que, si es necesario, los núcleos individuales estén en el mismo volumen TIFF de varias páginas. Utilice la indicación de núcleo roto (consulte el paso 4.3.4.9) para superar los espacios entre las piezas centrales.
      4. Convertidor: Si los volúmenes se han manipulado en otro paquete de software y se guardan fuera de la caja de herramientas (por ejemplo, ImageJ), realice este paso para obtener la información correcta del encabezado. Utilice este paso para volúmenes TIFF de varias páginas de 16 bits procedentes de otro escáner CT y para utilizar la caja de herramientas RingIndicator.
        NOTA: Todos los pasos a partir de aquí son para correcciones de dirección de la estructura y, finalmente, densitometría y análisis de anillos de árboles.
  3. Corrección de los ángulos y anillos indicadores en RingIndicator.
    NOTA: Los siguientes pasos deben seguirse cronológicamente en el módulo RingIndicator: (i) visualización del plano transversal y radial, (ii) corrección de la estructura, (iii) creación del perfil de densidad y (iv) indicación de los anillos de forma manual o semiautomática.
    1. Realice la visualización del plano transversal y radial como se describe a continuación.
      1. Para familiarizarse con la GUI, abra la caja de herramientas y seleccione un archivo TIFF de varias páginas (uno que se haya creado después de la extracción y después de que se corrigiera tg, es decir, del nombre de la carpeta Tg corregido).
      2. Seleccione la imagen de la mitad del grosor del sector para mostrar una imagen promedio de los sectores X centrales, con X que va de 1 a 10, donde 1 es ningún promedio (es decir, solo muestra el corte central) y 10 es una imagen promedio de los 10 sectores centrales.
        NOTA: El promedio puede ser beneficioso para resaltar mejor los bordes de los anillos y suprimir el ruido, por otro lado, también puede hacer que los bordes de los anillos se vean menos distintos, especialmente cuando el ángulo de la fibra es sustancial. Ajuste este valor de acuerdo con las necesidades. Es importante mencionar que esto es meramente para mostrar, no afecta el volumen subyacente, ni afecta los cálculos/resultados eventuales.
      3. Inspeccione la interfaz gráfica de usuario (GUI). La GUI contiene una figura superior con el plano transversal del núcleo y una figura inferior con el plano radial del núcleo, y un menú (Figura 8).
      4. Para cargar un nuevo volumen principal, busque la función Volumen > Cargar volumen para seleccionar un nuevo archivo TIFF de varias páginas en el directorio. Ahora el usuario está listo para indicar la dirección de la estructura para indicar posteriormente los anillos de árbol reales.
    2. Corrección de la estructura para facilitar la indicación automática de los anillos de los árboles.
      1. Haga clic manualmente en la imagen para insertar barras verdes para la corrección de la estructura. Comience con la médula (o el anillo más antiguo disponible) y termine con el anillo más reciente. A lo largo del núcleo corrija las desviaciones estructurales tanto en el plano transversal como en el radial.
      2. Asegúrese de indicar correctamente el ángulo del anillo y de la fibra, ya que todas las indicaciones posteriores tomarán un ángulo interpolado entre las indicaciones respectivas.
      3. Inserte una barra verde en un plano, automáticamente generará una en el otro plano. Después de insertar la barra, mueva los nodos (cuadrados blancos) al final de la barra para cambiar el ángulo. Utilice el nodo central para cambiar la posición de la barra. Ajuste el tamaño de los nodos para facilitar su uso.
      4. Después de cada paso, asegúrese de presionar Exportación de > de datos y Anillos > Exportar anillos, para asegurarse de que las indicaciones de anillo y fibra se escriban en los archivos de .txt adecuados. A lo largo de todas las correcciones, asegúrese de realizar siempre estas dos acciones.
    3. Cálculo del perfil de densidad.
      1. Utilice la gráfica Densitometría > Densitometría para calcular el perfil de densidad. Cree y trace un perfil de densidad seleccionando Trazado de superposición > Perfil de densidad de trazado, que puede servir como superposición en los planos principales.
      2. Para el cálculo de MXD, indique un porcentaje (el recomendado es del 20%, por ejemplo, el 20% significa que solo se incluye el 20% de los valores de densidad más altos), para excluir los valores más bajos de los conductos de resina, etcétera de madera temprana. Para los valores de densidad media, utilice 100%. Para la densidad mínima también use 100%.
    4. Realice la indicación manual y/o automática de los límites del anillo con un clic izquierdo del ratón por anillo, como se describe a continuación.
      NOTA: Inserte las mismas barras verdes que en el paso 4.3.2.1., esta vez el usuario debe hacer esto ahora anillo por anillo (Figura 9).
      1. Utilice Trazado de superposición > Perfil de densidad de trazado para visualizar el perfil de densidad en la imagen. Lo mejor es indicar el límite del anillo también junto con este perfil.
        NOTA: Abra tantas instancias de las cajas de herramientas como sea necesario, en combinación con la caja de herramientas CoreComparison (consulte más adelante).
      2. Para indicaciones automáticas (recomendadas para coníferas, por ejemplo), utilice Auto > detección Max/Min/Inflection . Esta función indicará automáticamente los límites de los anillos de los árboles en función del perfil de densitometría creado en el paso anterior. Para indicaciones automáticas (funciona mejor para coníferas boreales o especies con límites de anillo claros definidos por el perfil de densidad), utilice la detección automática > máx./min./inflexión . Esta función indicará automáticamente los límites de los anillos de los árboles en función del perfil de densitometría creado en el paso anterior.
      3. Dependiendo de la especie (porosa difusa/porosa en anillo o conífera), utilice el máximo/mínimo o la inflexión de la curva (justo después del pico de densidad) como criterio de límite del anillo del árbol. El primer parámetro es un umbral para la función de pico, el segundo es una función más suave.
      4. Después de realizar las indicaciones de anillo automatizadas, realice el cambio automático (con un tamaño de ventana de 1 píxel e iteraciones definidas por el usuario), mientras se asegura de que no se trazan indicaciones de anillo entre sí debido a este cambio y vuelva a ejecutar el gráfico de densitometría.
      5. Cambie la fecha de tala al año en que se tomaron los núcleos de incremento en árboles vivos o cualquier otra fecha que sea adecuada. El valor predeterminado es 1900.
      6. En Trazado de superposición, seleccione Anillos de trazado y se mostrarán los años. Seleccione también el plano en el que trazar los anillos y/o el perfil de densidad.
      7. Una vez que haya dos núcleos completamente indicados (por ejemplo, del mismo árbol), realice comparaciones por pares de las curvas de ancho del anillo del núcleo abriendo la caja de herramientas CoreComparison. Abra una instancia de RingIndicator por núcleo y edite las indicaciones si es necesario. Expórtelos de nuevo y utilice este enfoque iterativo e interactivo para obtener datos de buena calidad. En el siguiente paso (paso 4.4.1.), haga esto para todos los núcleos para exportar tanto los datos de TRW como los valores de densidad correspondientes.
      8. Verifique las posiciones de los anillos dobles en la opción Anillos > Verificar anillos ; Esto comprobará si alguna indicación tiene una posición fuera de las imágenes, así como anillos que se superponen, por ejemplo, en caso de que se haya producido un doble clic dos veces en la misma posición.
      9. En el caso de los núcleos rotos que tienen pedazos, hay que empezar por la médula y demarcar las anomalías (aire debido a los núcleos rotos, puntos brillantes debido a las bolsas de resina, la contaminación y las piezas descompuestas) como si fueran anillos para borrarlos después. Termine con el límite del anillo del árbol del último anillo formado y exporte los datos. Trate de evitar que se rompan los núcleos durante el muestreo (consulte los pasos 1.1 y39).
        NOTA: Se pueden indicar tanto los anillos faltantes como los rotos, consulte la Figura 10. Se definen dos casos, uno en el que el núcleo se rompe en medio de un anillo y otro en el que el núcleo se rompe en el límite de un anillo. Para el primero (Figura 10A), indique el espacio, observe el número de ese espacio seguido del número 1 y cierre los paréntesis. A continuación, el programa sumará las dos partes del anillo para obtener un valor de TRW correcto. En el segundo caso, se indica el número de espacio seguido del número 2, y el programa omitirá esta sección (Figura 10B).
      10. Al indicar anillos y generar perfiles de densidad, se crean y almacenan varios archivos .txt en la misma carpeta que los archivos TIFF de varias páginas, y los más importantes se enumeran en la Tabla 1. Mantenga estos archivos .txt en la misma carpeta que las imágenes TIFF, para poder tratarlos posteriormente en el módulo CoreComparison (paso 5.4).
        NOTA: Para calcular los valores de densidad de una manera diferente en función del perfil de densidad sin procesar (por ejemplo, ancho de madera tardía frente a ancho de madera temprana45 u otras métricas no compatibles con las cajas de herramientas CoreComparison y CoreProcessor), utilice los archivos de texto zpos_corr y density_corr y utilícelos para dichos cálculos.
  4. Para comparar series de TRW y exportar los datos a través de CoreComparison, siga los pasos que se indican a continuación.
    NOTA: Al utilizar esta caja de herramientas, se abren dos ventanas simultáneamente, el módulo CoreComparison y el módulo PatternMatching. El CoreComparison se ocupa de la datación cruzada y la exportación de datos TRW, mientras que el módulo PatternMatching se puede utilizar para exportar perfiles de densidad y valores de densidad (MXD, densidad mínima (MND), densidad media y valores de 4 cuartiles). El objetivo principal de CoreComparison es generar los valores de TRW y los valores de densidad, y tener una estimación aproximada de la calidad de la datación cruzada, con un acoplamiento a RindIndicator en caso de anillos faltantes o indicaciones incorrectas.
    1. Realice los siguientes pasos para la datación cruzada o la coincidencia del patrón de ancho del anillo con otras series.
      1. Una vez completada la sección RingIndicator, seleccione los archivos de texto a comparar y se abrirá una pantalla con anchos de anillo, junto con datos cruzados o parámetros estadísticos como Gleichlaüfigkeit (GLK)46 o la correlación de Spearman entre series individuales (Figura 11).
      2. Para realizar cambios en las indicaciones de los anillos (por ejemplo, durante las citas cruzadas), vuelva a abrir RingIndicator, importe los datos, exporte los datos modificados y los anillos, y utilice el botón Actualizar en el módulo CoreComparison (consulte la parte superior izquierda) para ver los cambios.
      3. Abra varias instancias de RingIndicator para realizar cambios en diferentes series de anillos de árbol y use varios monitores de pantalla para hacerlo.
      4. En el menú GLK y CORR (Figura 11), realice una serie de acciones relacionadas con GLK, como umbralizar las cifras, exportar los valores de GLK a una hoja de cálculo y clasificarlos.
    2. Obtenga los valores de TRW de CoreComparison como se describe a continuación.
      1. Utilice la función de trazado y exportación de CoreComparison para cambiar el desplazamiento entre las curvas (un valor mayor da como resultado un desplazamiento más pequeño). Visualice los datos de TRW en un trazado seleccionando Trazado y exportación > ancho de anillo.
      2. Exporte los datos de TRW haciendo clic en Trazar y exportar > Exportar datos RW. Exporte anchos de anillo en formato de hoja de cálculo o en formato Tucson.
    3. Obtenga los perfiles de densidad del módulo PatternMatching como se describe a continuación.
      1. Para obtener los perfiles de densidad en la hoja de cálculo, vaya al módulo PatternMatching , y después de cargar los perfiles, en el menú Otros seleccione Trazar > Exportar perfiles de densidad corregidos.
      2. Para agrupar perfiles de proceso o evaluar los datos utilizando diferentes métodos, utilice directamente los archivos .txt de la Tabla 1 (consulte el paso 4.3.4.11).
    4. Obtenga MXD, MND y otros valores de densidad del módulo PatternMatching como se describe a continuación.
      1. Para obtener la densidad media, MXD, MND y datos de cuartiles por anillo de árbol, utilice Otros trazados > Exportar datos agrupados. Se generará una hoja de cálculo que se puede encontrar en la misma carpeta que los archivos TIFF.
      2. Las pestañas de la hoja de cálculo se detallan en la Tabla 2. Exporte estas variables de anillo de árbol a Rstudio u otro software para su posterior análisis.

figure-protocol-29863
Figura 6. Obtención de valores de densidad de madera a partir de valores de gris. Conversión de los valores de gris de la imagen a estimaciones de densidad de madera reales, mediante calibración con un material de referencia. (A) Portamuestras 1, con una resolución de 60 μm, que muestra la referencia de aire, la referencia blanca y el núcleo. (B) También se muestra el portamuestras, a 20 μm, el aire, la referencia y el núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7. Pasos de preprocesamiento del volumen central 3D. Pasos de preprocesamiento del volumen del núcleo 3D antes de la visualización e indicación de los anillos del árbol. (A) Corrección de inclinación (axial), (B) corrección tangencial, con las barras grises que indican la dirección de la fibra, (C) el recorte del volumen del núcleo para obtener un volumen con solo vóxeles leñosos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8. Captura de pantalla de un núcleo. Captura de pantalla de un núcleo (ancho tangencial de aproximadamente 3 mm, resolución μm) abierto en la caja de herramientas RingIndicator. El panel superior es la vista transversal, el panel inferior es la vista radial. Las barras verdes muestran la indicación de la estructura (en este caso en el límite del anillo), la línea roja es el perfil de densidad. Los números amarillos indican el año calendario, y los números azules el número de anillo genérico (contando desde la primera indicación). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9. Indicación de anillo y visualización del perfil de densidad en el módulo RingIndicator. Las líneas verdes son indicativas, la línea roja es el perfil de densidad de la madera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-32939
Figura 10. Cómo lidiar con las grietas en los núcleos. (A) Cuando se produce una grieta en el centro del anillo, el número de anillo genérico (comenzando por la médula) se etiquetará como un espacio, y TRW se calculará sumando los anchos de las dos partes del anillo. Los parámetros son 3 (número del anillo) y 1 (caso 1: grieta en el centro de un anillo)31. (B) Cuando se produce una grieta en el límite de un anillo, el espacio se omitirá del cálculo de TRW. Los parámetros son 3 (número del anillo) y 2 (caso 2: grieta en el límite del anillo)31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-33932
Figura 11. Captura de pantalla del módulo de comparación de núcleos. Captura de pantalla del módulo de comparación de núcleos, donde las series de ancho de anillo se distribuyen verticalmente para facilitar la comparación visual. El panel superior muestra el ancho del anillo de 4 núcleos de Fagus sylvatica, el panel inferior izquierdo muestra el Gleichlaüfigkeit (GLK) y el panel inferior derecho el coeficiente de correlación de Spearman. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre de archivoExplicación
SAMPLENAME_density.txtValores de densidad no corregidos para toda la longitud de la imagen, por lo tanto, no corregidos para el ángulo del anillo y la fibra
SAMPLENAME _density_corr.txtcf. txt anterior pero luego con valores de densidad corregidos
NOMBRE DE LA MUESTRA _ring-and-fibre.txtIndicaciones de anillos y fibras Posiciones y ángulos
SAMPLENAME _zpos.txtPosición de los límites de los anillos de los árboles en el núcleo, sin corrección de anillos y fibras
NOMBRE DE MUESTRA _zpos.corr.txtídem como ZPo, pero luego corregido por el anillo y el ángulo de fibra
SAMPLENAME _ringwidth.txtAnchuras de anillo calculadas, teniendo en cuenta el ángulo del anillo y de la fibra

Tabla 1. Archivos de texto generados por RingIndicator. Lista de archivos de texto que se generan después de indicar anillos y exportar el perfil de densidad en RingIndicator. Estos deben permanecer en la misma carpeta que el archivo .tiff para poder abrirse en el módulo CoreComparison.

Variable de anillo de árbolExplicación
Densidad mediaDensidad media por anillo de árbol
Densidad máxima de base mediaMXD pero solo basado en la segunda mitad del anillo del árbol para evitar que no se incluyan los valores de alta densidad del año anterior
Densidad mínimala densidad mínima por anillo de árbol
Q1-Q4Valores medios y máximos para cada cuartil del perfil de anillo intraanual

Tabla 2. Detalles de la hoja de cálculo. Variables de anillo de árbol que se exportan a una hoja de cálculo denominada exportar datos agrupados.

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Resultados

Si el objetivo es la estimación de la biomasa o el incremento del crecimiento de los árboles de muchas muestras, es decir, la escala entre anillos (Figura 1), se utiliza el portamuestras 1 (Figura 5) para escanear las muestras y obtener perfiles de densidad (véase el paso 5.4.3) y estimaciones del crecimiento de los árboles, por ejemplo, para árboles de crecimiento rápido con TRW grande, lo que permite una resolución más gruesa. La F...

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Discusión

Pasos críticos dentro del protocolo
Los pasos críticos dentro del protocolo incluyen el manejo adecuado del barrenador de incremento para obtener núcleos de incremento de alta calidad (paso 1.1. y ver39) para evitar pedazos y piezas. A continuación, es esencial que los núcleos se dejen sin montar (pero ver26), tanto para la inserción en el portamuestras (Figura 5, ver21) como para la correcta extracción de resi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a los tres revisores anónimos por sus comentarios y sugerencias. Esta investigación fue financiada por el Fondo Especial de Investigación de BOF para JVdB (BOF Starting Grant BOF. STG.2018.0007.01), para el UGCT como Centro de Especialización (BOF. EXP.2017.0007) y como Instalación Principal (BOF. COR.2022.008), Los autores también agradecen a la Fundación de Investigación de Flandes (G019521N y G009720N) y al Fondo de Investigación Industrial (IOF) de UGent por el apoyo financiero a la infraestructura a través de la subvención IOF. APP.2021.0005 (proyecto FaCT F2021/IOF-Equip/021).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
6 mm paper straws http://artstraws.com/education/product/artstraws-thick-asst-cols/Coring
Aluminium core holders
ASTM standard ASTM D 1107 – 96
Cardboard postal tubeshttps://www.rajapack.co.uk/envelopes-mailing-bags/postal-tubes/1-5-2mm-brown-cardboard-postal-tubes_PDT05623.html
Column drill
Computer hardware for reconstruction and analysisX-ray CT scanning
Cooling 
Drying oven
Ethanol 
Flask for under soxhlet (2000 ml)
Floral foamhttps://www.oasisfloral.eu/Sample holder type 1
Glass beads to fill void volume of Soxhlet to save solvent
Glue
Hot water bath https://www.memmert.com/products/water-baths/water-bath/#!filters=%7B%7DSoxhlet extraction
Increment borer https://haglofsweden.com/project/increment-borers/
Plastic cylinder Moonen et al. 2022 Sample holder type 2
Plastic cylinders
Reservoir
Tailored soxhlet apparatus 
Toluene 
Water pump 
X-ray CT scanner

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