Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

Resumen

El metanol se puede utilizar como medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo, lo que es útil para la investigación de las células ganglionares de la retina.

Resumen

Las células ganglionares de la retina (CGR), que son las neuronas de proyección de la retina, propagan información visual externa al cerebro. Los cambios patológicos en las CGR tienen una estrecha relación con numerosas enfermedades degenerativas de la retina. La inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza con frecuencia en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones de desarrollo y patológicas de la retina. En algunas circunstancias, algunas muestras valiosas de retina, como las de ratones transgénicos, pueden necesitar ser retenidas durante un largo período sin afectar la morfología o el número de CGR. Para obtener resultados experimentales creíbles y reproducibles, es esencial utilizar un medio de conservación eficaz. Aquí, describimos el efecto del metanol como un medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo. En resumen, durante el proceso de aislamiento, el metanol frío (-20 ° C) se pipetea sobre la superficie de la retina para ayudar a fijar los tejidos y facilitar su permeabilidad, y luego las retinas se pueden almacenar en metanol frío (-20 ° C) antes de ser inmunoteñidas. Este protocolo describe el flujo de trabajo de aislamiento de retina y el protocolo de almacenamiento de muestras de tejido, que es útil y práctico para la investigación de CGR.

Introducción

Las células ganglionares de la retina (CGR) son las únicas neuronas de proyección en la retina, e integran y transmiten información visual externa al cerebro¹. Muchas enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma y la neuropatía óptica traumática se caracterizan por daño irreversible y pérdida de CGR ^2,3. El análisis de los cambios morfológicos y cuantitativos de las CGR es un paso crucial para determinar cómo se desarrollan y avanzan las enfermedades neurodegenerativas ^4,5.

El ensayo de inmunofluo....

Protocolo

Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Todos los ratones C57BL / 6J utilizados se obtuvieron del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Wuhan, y todos los experimentos relacionados fueron aprobados por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Wuhan. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los ratones.

1. Enucleación y fijación de los ojos

1. Eutanasia a los ratones con asfixia de dióxido de carbono y enuclear el globo ocular suavemente usando pinzas sin dientes.
2. Enjuague el globo ocular ....

Discusión

La fijación es un paso esencial para preservar la retina, lo que puede afectar cualquier investigación posterior de RGC basada en la morfología. La fijación exitosa captura rápidamente la estructura y el estado de las retinas en el momento de exponerlas al medio de fijación, lo cual es crítico para un análisis posterior. Aunque el formaldehído ha sido considerado como uno de los agentes fijadores más comunes para la fijación y preservación de tejidos y células, el formaldehído por sí solo no siempre funcio.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools