Evaluación del tamaño y la fusión de gotas de lípidos en células hepáticas bovinas

Resumen

El presente protocolo describe cómo usar O rojo aceite para teñir gotas de lípidos (LD), calcular el tamaño y el número de LD en un modelo de hepatocitos grasos inducido por ácidos grasos, y usar BODIPY 493/503 para observar el proceso de pequeños LD que se fusionan en LD grandes mediante imágenes de células vivas.

Resumen

Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos que desempeñan un papel importante en el metabolismo de los lípidos y el almacenamiento de lípidos neutros en las células. Se asocian con una variedad de enfermedades metabólicas, como la obesidad, la enfermedad del hígado graso y la diabetes. En las células hepáticas, los tamaños y el número de LD son signos de enfermedad del hígado graso. Además, la reacción de estrés oxidativo, la autofagia celular y la apoptosis a menudo se acompañan de cambios en los tamaños y números de LDs. Como resultado, las dimensiones y la cantidad de LD son la base de la investigación actual sobre el mecanismo de la biogénesis de LD. Aquí, en células hepáticas bovinas inducidas por ácidos grasos, describimos cómo usar el aceite rojo O para teñir LD e investigar los tamaños y números de LDs. La distribución de tamaño de los LD se analiza estadísticamente. El proceso de fusión de LD pequeños en LD grandes también se observa mediante un sistema de imágenes de células vivas. El trabajo actual proporciona una manera de observar directamente la tendencia de cambio de tamaño de las LD bajo diferentes condiciones fisiológicas.

Introducción

La acumulación de gotitas de lípidos (LD) en los hepatocitos es la característica típica de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), que puede progresar a fibrosis hepática y carcinoma hepatocelular. Se ha encontrado que la manifestación más temprana de la enfermedad del hígado graso es la esteatosis, caracterizada por la acumulación de LD en el citoplasma del hepatocito¹. La esteatosis hepática se asocia invariablemente con un aumento del número y/o tamaño expandido de LDs². Se cree que los LD se generan a partir del retículo endoplásmico (RE), que consiste en triglicéridos (TG) como núcleo, y están rodeado....

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con los estándares éticos del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Agrícola de Henan (provincia de Henan, China).

1. Cultivo de células de hepatocitos bovinos

1. Descongelar las células de hepatocitos primarios¹⁷ y centrifugar 400 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Las células hepatocitos primarias fueron cultivadas y mantenidas después de un informe previamente publicado¹⁷.
2. Deseche la solución de almacenamiento congelada con una pipeta y suspenda con 1 ml de ....

Discusión

Dependiendo de los estados patológicos, los LD hepáticos experimentan cambios tremendos en su tamaño y número. Las LD están ampliamente presentes en las células hepatocitos y desempeñan un papel clave en la salud y enfermedad hepática¹⁸. La cantidad y el tamaño de las LD son la base de la investigación actual sobre la biogénesis de las LD¹⁹. El tamaño y el número de LD para células y tejidos reflejan su capacidad para almacenar y liberar energía. Los cambios .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent