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Resumen

Este protocolo describe un modelo de acumulación de lipofuscina en cultivos epiteliales pigmentarios (EPR) humanos altamente diferenciados y polarizados y un ensayo de fagocitosis de segmento externo (SG) mejorado para detectar la capacidad total de consumo/degradación de SG del EPR. Estos métodos superan las limitaciones de los modelos anteriores de lipofuscina y los ensayos clásicos de fagocitosis del segmento externo de persecución de pulsos.

Resumen

La fagocitosis diaria de los segmentos externos de los fotorreceptores por el epitelio pigmentario de la retina (EPR) contribuye a la acumulación de un pigmento de envejecimiento intracelular denominado lipofuscina. La toxicidad de la lipofuscina está bien establecida en la enfermedad de Stargardt, la degeneración retiniana hereditaria más común, pero es más controvertida en la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la principal causa de ceguera irreversible en el mundo desarrollado. Determinar la toxicidad de la lipofuscina en humanos ha sido difícil, y los modelos animales de Stargardt tienen una toxicidad limitada. Por lo tanto, se necesitan modelos in vitro que imiten el EPR humano in vivo para comprender mejor la generación, eliminación y toxicidad de la lipofuscina. La mayoría de los modelos de lipofuscina de cultivo celular hasta la fecha han estado en líneas celulares o han implicado alimentar al EPR con un solo componente de la mezcla compleja de lipofuscina en lugar de fragmentos/puntas de todo el segmento externo de los fotorreceptores, lo que genera un modelo de lipofuscina más completo y fisiológico. Aquí se describe un método para inducir la acumulación de material similar a la lipofuscina (denominado material de autofluorescencia no digerible, o UAM) en RPE prenatal humano primario altamente diferenciado (hfRPE) y RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). La UAM se acumuló en cultivos mediante la alimentación repetida de fragmentos de SG tratados con luz ultravioleta absorbidos por el EPR a través de fagocitosis. También se discuten las formas clave en que UAM se aproxima y difiere de la lipofuscina in vivo . Acompañando a este modelo de acumulación similar a la lipofuscina, se introducen métodos de imagen para distinguir el amplio espectro de autofluorescencia de los gránulos de UAM de la tinción concurrente de anticuerpos. Finalmente, para evaluar el impacto de UAM en la capacidad de fagocitosis del EPR, se ha introducido un nuevo método para cuantificar la captación y descomposición de fragmentos / puntas del segmento externo. Denominado "capacidad consuntiva total", este método supera posibles interpretaciones erróneas de la capacidad de fagocitosis del EPR inherente a los ensayos clásicos de "persecución de pulsos" del segmento externo. Los modelos y técnicas introducidos aquí se pueden utilizar para estudiar las vías de generación y eliminación de lipofuscina y la toxicidad putativa.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) proporciona un soporte crítico para los fotorreceptores suprayacentes, incluida la absorción diaria y la degradación de las puntas o fragmentos del segmento externo de los fotorreceptores (a lo largo de este protocolo, la abreviatura OS significa puntas o fragmentos del sistema operativo en lugar de segmentos externos completos). Esta absorción diaria en el EPR postmitótico eventualmente sobrecarga la capacidad fagolisosomal y conduce a la acumulación de material intracelular autofluorescente no digerible, denominado lipofuscina. Curiosamente, varios estudios también han demostrado que la lipofuscina RPE puede acumularse sin fagocitosis OS 1,2. La lipofuscina tiene muchos componentes, incluidos los aductos reticulados derivados de los retinoides del ciclo visual, y puede ocupar casi el 20% del volumen de células del EPR para los mayores de 80años.

Si la lipofuscina es tóxica ha sido objeto de acalorados debates. La enfermedad de Stargardt es una degeneración autosómica recesiva de los fotorreceptores y el EPR en la que una mutación en ABCA4 desencadena un procesamiento inadecuado de los retinoides del ciclo visual contenidos dentro de los segmentos externos de los fotorreceptores. El procesamiento inadecuado de retinoides conduce a la reticulación aberrante y la formación de especies de bis-retinoides, incluyendo el bis-retinoide N-retinilideno-N-retiniletanolamina (A2E). Los estudios han demostrado múltiples mecanismos para la toxicidad de A2E 4,5. La lipofuscina contribuye a las señales de autofluorescencia del fondo de ojo durante la imagen clínica, y tanto los pacientes de Stargardt como los modelos animales muestran un aumento de la autofluorescencia del fondo de ojo antes de la degeneración retiniana, lo que sugiere una correlación entre los niveles de lipofuscina y la toxicidad 6,7. Sin embargo, con la edad, la lipofuscina se acumula en todos los seres humanos sin desencadenar una degeneración del EPR. Además, en la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), donde la degeneración del EPR ocurre solo en pacientes de edad avanzada, aquellos con formas tempranas e intermedias de la enfermedad tienen menos señales de autofluorescencia del fondo de ojo que los humanos no enfermos de la misma edad8. Estos hallazgos clínicos han sido verificados también a nivel histológico 9,10.

Los modelos animales de acumulación de lipofuscina RPE también han dejado cierta ambigüedad sobre la toxicidad de la lipofuscina. El ratón knockout ABCA4 no muestra degeneración retiniana sobre un fondo pigmentado, mientras que sí lo hace sobre un fondo albino o cuando se expone a la luz azul11,12. Además, la toxicidad de la lipofuscina derivada a través del knockout ABCA4 probablemente difiere de la lipofuscina de acumulación más lenta que ocurre con el envejecimiento natural, como se ve en AMD13.

Los modelos in vitro de acumulación de lipofuscina proporcionan una alternativa al estudio de los efectos de la acumulación de lipofuscina en la salud del EPR. Tales modelos permiten manipular los componentes de la lipofuscina, desde la alimentación de componentes retinoides individuales hasta la alimentación de SG, y permiten el estudio en RPE humano en lugar de animal. En las últimas dos décadas, se han desarrollado múltiples métodos para modelar la lipofuscina RPE en cultivo. Junto con otros grupos, el grupo del Dr. Boulton alimentó la SG bovina diariamente durante un máximo de tres meses al pasar de 4 a 7 células RPE primarias humanas de donantes de 4 a 85 años de edad14. Alternativamente, la inhibición de la autofagia también ha llevado a la acumulación de lipofuscina en los pasajes 3 a 7 cultivos primarios de EPR humanos15. Sin embargo, la inhibición lisosomal subletal en cultivos de EPR prenatal humano primario (eRPH) altamente diferenciados, pasaje 1, no logró inducir lipofuscina, incluso con la adición repetida de SGdiariamente 16.

Como un enfoque más reduccionista, otros han alimentado componentes individuales de lipofuscina a cultivos, especialmente el bis-retinoide A2E 4,17. Tales estudios son valiosos porque definen posibles mecanismos directos de toxicidad para componentes individuales de lipofuscina, implicando, por ejemplo, el colesterol lisosomal y la homeostasis de ceramida18. Al mismo tiempo, existe un debate sobre la toxicidad de A2E19, y alimentarlo directamente a las células elude la vía típica para la acumulación de lipofuscina, que implica la fagocitosis de la SG fotorreceptora. En un intento de administrar todos los componentes de la lipofuscina a los cultivos de EPR, Boulton y Marshall purificaron la lipofuscina de los ojos humanos y la alimentaron con el paso de 4 a 7 cultivos primarios de EPR humanos derivados de donantes humanos fetales y ancianos20. Aunque innovador, este método representa una fuente limitada de lipofuscina para experimentos repetidos.

Mientras que la alimentación repetida de SG a cultivos de EPR produce lipofuscina en muchos sistemas, no lo hace en cultivos primarios de EPR altamente diferenciados16. La SG fotooxidante induce reacciones de reticulación como la formación de bis-retinoides que ocurre naturalmente durante la formación de lipofuscina in vivo. Esto puede acelerar la formación de gránulos similares a la lipofuscina en sistemas de cultivo de EPR, incluso aquellos que son altamente diferenciados y resistentes a la acumulación de lipofuscina16. Aquí, se introduce un método para inducir la acumulación de gránulos similares a la lipofuscina en hfRPE altamente diferenciado y iPSC-RPE humano, modificado del protocolo21 publicado por Wihlmark. Este método tiene la ventaja de inducir gránulos similares a la lipofuscina empleando la misma fuente (SG fotorreceptora) y vía (captación de SG fagolisomal) que ocurre para la lipofuscinogénesis in vivo. Además, se realiza en cultivos humanos de EPR altamente diferenciados y validados en múltiples estudios para replicar el EPR humano in vivo22,23,24. Estos gránulos similares a la lipofuscina se denominan material autofluorescente no digerible (UAM), y proporcionan datos y discusión en este protocolo que compara UAM con lipofuscina in vivo. Junto con los métodos para construir y evaluar cultivos cargados de UAM en RPE humano altamente diferenciado, también se introduce un método actualizado para evaluar la fagocitosis de SG RPE. Se han introducido múltiples métodos excelentes de persecución de pulsos para cuantificar la fagocitosis de SG, incluyendo Western blotting, inmunocitoquímica y FACS25,26,27. Sin embargo, al principio de la persecución del pulso del sistema operativo, las condiciones que conducen a una absorción deficiente del sistema operativo pueden combinarse con las condiciones que promueven la rápida degradación del sistema operativo internalizado. El método presentado aquí mide la cantidad total de sistema operativo introducido que es completamente consumido / degradado por el RPE ("Capacidad consuntiva total"), ayudando a eliminar esta ambigüedad. Se anticipa que los conocimientos sobre la toxicidad de la lipofuscina utilizando estos protocolos, incluidos los efectos sobre las tasas de fagocitosis de SG utilizando el método de "Capacidad consuntiva total", se utilizarán para arrojar luz sobre la toxicidad de la lipofuscina in vivo.

Protocolo

El presente protocolo que implica la adquisición y el uso de tejido humano fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Michigan (HUM00105486).

1. Preparación de puntas y fragmentos de segmentos externos fotooxidados

NOTA: Las retinas bovinas adaptadas a la oscuridad se compraron y se enviaron en hielo (consulte la Tabla de materiales). A partir de estas retinas, la SG fue purificada siguiendo un protocolo previamente publicado23.

  1. Reticulación del segmento exterior con una lámpara UV
    1. Sumerja los portaobjetos recubiertos de politetrafluoroetileno (consulte la Tabla de materiales) completamente en etanol al 70% durante 10 minutos en un gabinete de bioseguridad para esterilizar los portaobjetos. Deje que los portaobjetos se sequen al aire en una placa estéril de cultivo celular de 100 mm.
    2. Coloque cada portaobjetos en una nueva placa de cultivo celular de 100 mm y agregue 200 μL de medios de cultivo celular que contengan suero (cualquier medio que se use típicamente para los cultivos de EPR en cuestión) en cada rectángulo, luego coloque una luz UV de 254 nm de mano (consulte la Tabla de materiales) en la placa de cultivo celular de 100 mm (sin tapa) con la bombilla directamente hacia el portaobjetos, y exponer durante 20 min. Los medios utilizados específicamente para este estudio y los números de producto específicos para los componentes de los medios han sido publicados previamente22,23. Este medio se denomina "medios RPE" a lo largo de este protocolo.
      NOTA: El tratamiento UV de los medios bloquea la superficie de vidrio y evita que el sistema operativo se pegue durante los siguientes pasos.
    3. Descongelar las alícuotas congeladas de OS a 37 °C (en la mano o en baño maría). La cantidad de sistema operativo necesario depende de la aplicación. En general, se pueden tratar hasta 500 μL de 2 x 108 OS/mL por rectángulo en el portaobjetos.
    4. Una vez descongelado, gire el sistema operativo a 2400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Aspirar inmediatamente el sobrenadante en el gabinete de bioseguridad usando una pipeta en lugar de un vacío para evitar la pérdida accidental del pellet.
    5. Resuspenda suavemente el pellet con PBS estéril.
      NOTA: Realice un seguimiento del volumen resuspendido y la concentración esperada. por ejemplo, la resuspensión del pellet de un tubo de 1 ml de 1 x 10 8 OS/mL con 500 μL PBS produce 2 x 108 OS/mL. El volumen y la concentración máximos por rectángulo en el portaobjetos recubierto de politetrafluoroetileno es de 500 μL de 2 x 108 OS/ml.
    6. Aspirar el medio de los portaobjetos y colocar hasta 500 μL de 2 x 108 OS/ml de solución de PBS en cada rectángulo del portaobjetos. Coloque la luz UV de mano sobre la placa de cultivo celular (sin tapa) con la bombilla directamente hacia el sistema operativo. Exponga la solución del sistema operativo a una luz de 254 nm durante 40 minutos.
      NOTA: Durante la exposición de 40 minutos, cubra la lámpara UV y el plato con una toalla o almohadilla absorbente, cierre la hoja del gabinete de bioseguridad y apague el soplador. Esto evitará que se produzca una evaporación significativa. Si la lámpara UV utilizada en este protocolo no está disponible para un investigador, existen dos alternativas para garantizar que se logre la cantidad adecuada de reticulación. La primera es seguir la exposición UV cuantitativa descrita en el paso 1.2, ya sea con el dispositivo descrito en el paso 1.2 u otro dispositivo que pueda proporcionar la misma exposición radiante cuantitativa que dicho dispositivo en 1.2. Otra alternativa es exponer la SG a la irradiación UV durante un tiempo que induzca el grado de reticulación en la tinción de Coomassie que se observa en la Figura 1C.
    7. Recoja la solución de PBS para SG tratada en tubos de microcentrífuga estériles, vuelva a lavar el rectángulo del portaobjetos recubierto con 200-500 μL de PBS (2-3x) y recoja cada lavado en el tubo de microcentrífuga. Una vez hecho esto, mire el portaobjetos bajo un microscopio de la sala de cultivo de tejidos para confirmar que casi todos los sistemas operativos se han eliminado del portaobjetos.
    8. Triturar la solución de PBS del sistema operativo a 2400 x g durante 5 min a temperatura ambiente, aspirar el PBS en el armario de bioseguridad con un pipetor y volver a suspender en un medio patrón de 500 μL que se utilizará para cultivos de EPR (por ejemplo, "medios de EPR" definidos en la sección 1.1.2). El volumen de resuspensión se puede ajustar en función de la concentración deseada de OS fotooxidada (OxOS).
    9. Coloque 10 μL de la suspensión en un nuevo tubo de microcentrífuga, diluya 50-100x con más medios de cultivo celular y cuente los sistemas operativos con un hemocitómetro.
    10. Según el recuento de OS, diluya la suspensión de OxOS a una concentración de stock final. Para la alimentación de cultivos de EPR altamente maduros en pozos transbordadores de 24 pocillos (área superficial de 0,33 cm 2; ver Tabla de materiales), se recomienda una concentración final de medios de 2 x 107 OS/mL.
      1. Para lograr esto, distribuya el OxOS en alícuotas de 25 μL a una concentración de 5.6 x 107 OS/mL, suspendidas en medios de cultivo estándar de EPR. Después de descongelar una alícuota de 25 μL, mezclar toda la alícuota con 45 μL de medios de cultivo estándar de EPR, proporcionando un volumen final de medios de 70 μL y una concentración de SG de 2 x 107 OS/ml para cada alimentación de OxOS Transwell.
    11. Antes de alícuota el OxOS, agregue ligandos puente de fagocitosis (proteína S y MFG-E8, ver Tabla de materiales), que facilitan la absorción de SG y la acumulación de lipofuscina. Las concentraciones de trabajo de los ligandos puente en un Transwell de 24 pocillos son 4 μg/ml para la proteína S purificada humana y 1,5 μg/ml para la MFG-E8 humana recombinante. Así, para alícuotas de 25 μL de OxOS a 5,6 x 107 OS/ml, la concentración madre para la proteína S es de 11,2 μg/ml, y para MFG-E8 es de 4,2 μg/ml.
      NOTA: Las concentraciones de ligando puente se optimizaron para cultivos de hfRPE en transwell de 24 pocillos, con un recuento celular aproximado de 320.000 células por 0,33 cm2 de pocillo. Las concentraciones de ligandos pueden necesitar ser ajustadas para otros tipos de EPR y densidades celulares, ya que los ligandos presentes en exceso de la disponibilidad del receptor de fagocitosis pueden, paradójicamente, bloquear la captación de SG28.
    12. Congelar rápidamente las alícuotas en nitrógeno líquido.
      NOTA: Las congelaciones y descongelaciones múltiples son muy perjudiciales para la integridad del sistema operativo.
  2. Reticulación del segmento exterior con un dispositivo de reticulación UV
    NOTA: Siga el paso 1.1, con la excepción de los pasos siguientes, que reemplazan los pasos 1.1.2 y 1.1.6, respectivamente:
    1. (sustituye al paso 1.1.2) Coloque cada portaobjetos en una nueva placa de cultivo celular de 100 mm y agregue 200 μL de medios de cultivo celular que contengan suero (por ejemplo, "medios RPE" o cualquier otro sustituto) en cada rectángulo, luego coloque los portaobjetos en un dispositivo de reticulación ultravioleta (consulte la Tabla de materiales), tratando con UV de 254 nm a una exposición radiante de 3-6 J / cm2 para bloquear la superficie del vidrio y evitar que el sistema operativo se pegue durante los siguientes pasos.
    2. (sustituye al paso 1.1.6) Aspirar los medios de los portaobjetos y colocar hasta 500 μL de 2 x 108 OS/ml en PBS estéril en cada rectángulo del portaobjetos. Coloque los portaobjetos en el dispositivo de reticulación ultravioleta, ajuste la exposición radiante de tratamiento según sea necesario (3-9 J / cm2) y trate a 254 nm.
      NOTA: La exposición radiante necesaria puede determinarse cuidadosamente titulando la exposición radiante entre 3-9 J/cm2 hasta que se logre el grado de autofluorescencia y la reticulación de proteínas (como se ve en la Figura 1B y la Figura 1C).
      PRECAUCIÓN: La manipulación de la SG fuera de un gabinete de bioseguridad puede provocar contaminación. Después de la exposición del sistema operativo al dispositivo de reticulación UV, recoja el sistema operativo con puntas de pipeta estériles, transfiéralo a tubos de microcentrífuga estériles y maneje todos los pasos adicionales en la campana de bioseguridad.
  3. Caracterización de SG oxidada
    1. Cuantificar el espectro de emisión de autofluorescencia mediante imágenes
      1. Coloque 20-50 μL de solución madre de SG y OxOS no tratadas en dos tubos de microcentrífuga separados. Centrifugar a 2400 x g durante 5 min a temperatura ambiente, resuspender el pellet en paraformaldehído al 4% tamponado (por ejemplo, PBS) y fijar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
      2. Después de la fijación, gire hacia abajo como se indica arriba, lave con PBS x 2 (girando entre lavados), luego vuelva a suspender en menos de 30 μL de PBS.
      3. Coloque unos pocos microlitros de la resuspensión en un portaobjetos de microscopio, agregue medios de montaje (consulte Tabla de materiales) y, finalmente, un cubreobjetos.
      4. Imagen de OxOS en un microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales).
        NOTA: La autofluorescencia OxOS puede ser excitada por una amplia gama de longitudes de onda láser, pero normalmente se emplea una línea láser de 405 nm o 488 nm. La emisión es igualmente amplia, pero una configuración típica del filtro de excitación/emisión GFP/FITC es adecuada para ver la autofluorescencia.
      5. Para medir el espectro de emisión de OxOS, utilice el escaneo λ en un microscopio confocal. Los ajustes típicos de escaneo λ incluyen excitación con 405 nm o 488 nm, y detección de emisión que varía desde 10 nm desplazados al rojo desde la línea de excitación láser hasta aproximadamente 800 nm, con un tamaño de paso λ de 10 nm. Cada sistema de microscopía tiene sus propias instrucciones sobre cómo emplear el modo λ, y el lector debe consultar el manual para su confocal específico.
    2. Como alternativa, cuantificar la autofluorescencia por citometría de flujo.
      1. Girar 2 x 10 7 SG no tratada y separar 2 x 107 OxOS en tubos de microcentrífuga y resuspender en 1 ml de PBS.
        NOTA: No se requiere fijación si la citometría de flujo se realiza directamente después de la descongelación.
      2. Cargue muestras de SG y OxOS no tratadas en un citómetro de flujo (consulte la Tabla de materiales). Ajuste la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC) a un spread aceptable en el gráfico de dispersión FSC-SSC. Utilice PBS como control para descartar cualquier partícula pequeña contaminante. Tenga en cuenta que los sistemas operativos son considerablemente más pequeños que las celdas.
      3. Utilice el canal FITC estándar del citómetro de flujo para la cuantificación de autofluorescencia. Cuenta al menos 10.000 eventos. Utilice el valor del área de pulso del histograma FITC para representar la intensidad de la fluorescencia.
        NOTA: Para el presente estudio, todos los datos se analizan utilizando el software de análisis del citómetro de flujo (ver Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Evaluar el grado de reticulación en OxOS
      1. Girar 2 x 10 7 OS no tratadas y por separado 2 x 107 OxOS en tubos de microcentrífuga. Retire el sobrenadante y lisar directamente el pellet agregando 1.2x Laemmli Sample Buffer (suficiente para cubrir; ver Tabla de materiales). Vórtice, mantener a temperatura ambiente durante 30 min, girar hacia abajo a temperatura ambiente igual o superior a 12000 x g durante 10 min, y recoger sobrenadante.
        NOTA: La evaluación del grado de reticulación de proteínas en OxOS da una idea de la idoneidad del tratamiento UV. Se realiza una comparación entre la SG no tratada y la OxOS, y la reticulación adecuada ocurre cuando la banda monomérica de rodopsina que domina la tinción de Coomassie (Figura 1C, flecha) es apenas perceptible, con el surgimiento de agregados de orden superior y un frotis de proteína en la parte superior del gel.
        PRECAUCIÓN: Cuando use Sample Buffer para lisar el sistema operativo, no caliente posteriormente la solución de lisis, ya que esto puede desencadenar la agregación de rodopsina. También evite enfriar el sistema operativo lisado hasta que esté listo para el almacenamiento, ya que esto precipitará SDS. Los lisados no utilizados pueden mantenerse a -20 °C. Si se vuelve a colocar, asegúrese de que los lisados estén completamente descongelados a temperatura ambiente antes de usarlos.
      2. Cuantificar la concentración de proteínas utilizando un ensayo de proteínas tolerante a altas concentraciones de SDS y reductoras29. Consulte la Tabla de materiales para obtener sugerencias sobre los reactivos de ensayo de proteínas apropiados y siga el protocolo del fabricante para estos reactivos.
      3. Ejecute muestras de OS y OxOS no tratadas mediante electroforesis SDS-PAGE 30 en un gel de gradiente de 4% -15%, empleando tampónSDS de tris-glicina estándar. El gel se ejecuta a 80 V hasta que las muestras entran en la pila, luego a 120 V durante 50-60 minutos a temperatura ambiente.
      4. Manchar el gel con azul de Coomassie utilizando los protocolos estándar31. La tinción de Coomassie demostrará la idoneidad de la reticulación inducida por el tratamiento UV.

2. Construcción de gránulos similares a la lipofuscina (UAM) en cultivos de EPR

  1. Alimentación con OxOS: cantidad, frecuencia y ligandos puente de fagocitosis
    NOTA: La alimentación ocurre en cultivos humanos de iPSC-RPE o hfRPE en el pasaje 1, cultivados de acuerdo con el protocolo descrito por el laboratorio de Bharti (para iPSC-RPE)32 o nuestro protocolo previamente descrito para hfRPE, adaptado del laboratorio de Sheldon Miller22,23. Todos los cálculos a continuación se basan en la alimentación de OxOS o OS a un Transwell de 24 pocillos (6,5 mm de diámetro, 0,33 cm2 de área de crecimiento).
    1. Descongelar 25 μL de 5,6 x 107 OxOS/ml a 37 °C y añadir 45 μL de medios de cultivo celular a la alícuota de OxOS, dando como resultado un volumen final de 70 μL.
      NOTA: Las alícuotas de OxOS preparadas en el paso 1 contendrán ligandos puente de fagocitosis MFG-E8 y proteína S. Sin embargo, si esos ligandos no se agregaron a las alícuotas antes de la congelación, se pueden agregar en este paso, asegurando que la concentración final de los ligandos en los medios que se alimentarán con células sea de 4 μg / ml para la proteína S y 1.5 μg / ml para MFG-E8. Como se indica en el paso 1.1.11, puede ser necesario alterar las concentraciones de ligandos puente para otros tipos de EPR o densidades celulares.
    2. Retire los medios apicales de Transwell y agregue 70 μL de 2 x 107 OxOS/ml con los ligandos puente de fagocitosis a la cámara apical. Después de 24 h, retire y reemplácelo con una nueva alimentación OxOS. La alimentación ocurre diariamente durante los días de semana, saltándose los fines de semana, hasta que se completen 20 alimentaciones (~ 1 mes). Cambiar los medios de cultivo de células basolaterales (400-550 μL) 2-3x/semana.
    3. Al completar 20 alimentaciones, reanude los cambios normales de medios para el pozo.
      NOTA: Se necesitan varios cambios adicionales en los medios para eliminar el OxOS pegajoso de la superficie apical del EPR, por lo que los experimentos con los cultivos cargados de UAM deben realizarse al menos 1-2 semanas después de que concluyan las alimentaciones con OxOS.
      PRECAUCIÓN: Es importante tener controles adecuados para la acumulación de UAM a través de la alimentación con OxOS. Como los cambios diarios en los medios pueden afectar la biología del EPR, se recomiendan los siguientes pocillos de control: Control 1: Reemplace los medios diariamente durante los días laborables para el mismo número de alimentaciones que el grupo tratado con OxOS. Control 2: Alimente la SG no tratada con EPR diariamente durante los días laborables a la misma concentración y volumen que la alimentación con OxOS, para el mismo número de alimentaciones.
  2. Monitorización de la salud de cultivos cargados con gránulos similares a la lipofuscina mediante ensayos de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y muerte celular
    NOTA: Durante y después de la alimentación con OxOS, la salud de los cultivos de EPR se puede medir evaluando la integridad de la unión estrecha del EPR y la muerte celular. Se ha demostrado previamente que la evaluación de la integridad de la unión estrecha, a través de la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), es un marcador sensible para la salud celular general33. También se pueden emplear marcadores no invasivos más tradicionales de muerte celular, como la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).
    1. Realizar TEER
      NOTA: TEER se prueba con un medidor de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y un electrodo TEER, generalmente siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
      1. Para esterilizar el electrodo TEER, use un limpiaparabrisas de tareas empapado en etanol al 70% para limpiar el electrodo y luego sumerja las puntas de la sonda del electrodo en etanol al 70% durante 10 minutos.
      2. Deje que el electrodo se seque completamente, luego sumerja el electrodo en un medio estéril.
      3. Retire la sonda de los medios estériles e inserte las dos sondas del electrodo TEER en las cámaras apical y basolateral de un Transwell cultivado; La punta de la sonda más larga encaja en la cámara basolateral.
        NOTA: Es fácil raspar la parte inferior de la cámara apical con el electrodo TEER sin práctica, y dicho raspado alterará drásticamente las lecturas de TEER a medida que se interrumpe la monocapa de RPE confluente. Por lo tanto, se recomienda que los principiantes practiquen en Transwells no importantes antes de probar en cultivos experimentales de RPE. Además, después de probar cada placa de cultivos de EPR, el experimentador debe verificar si hay raspado de la monocapa de EPR bajo un microscopio de cultivo de tejidos estándar.
      4. Una vez que las sondas apicales y basolaterales estén en su lugar en el Transwell, presione el botón de lectura o pise el interruptor de pie del medidor para registrar el TEER. Entre placas o grupos de celdas, lave la sonda del electrodo con medios estériles. Si la infección es una preocupación alta, vuelva a esterilizar entre placas.
      5. Calcule TEER tomando la lectura de resistencia del medidor, restando el valor de un Transwell en blanco con medios pero sin celdas (generalmente 100-110 Ω para un Transwell de 24 pocillos con 0.33cm2 de área de superficie), y luego multiplicando por el área de superficie del Transwell.
        NOTA: Los valores TEER deben notificarse normalizados al área de superficie celular. Los valores típicos para cultivos sanos de hfRPE varían de 350 a 1100 Ωcm2. Los valores de TEER aumentan a medida que disminuye la temperatura. Por lo tanto, al eliminar cultivos de una incubadora a 37 °C a una campana a temperatura ambiente, los valores TEER tenderán a aumentar en toda la placa. Para protegerse contra esta variabilidad, trabaje rápidamente (si experimenta) o espere de 10 a 15 minutos para que la temperatura de la placa se equilibre con la temperatura ambiente.
    2. Realizar ensayo de liberación de LDH
      NOTA: La liberación de LDH en el sobrenadante de cultivo celular ocurre durante la muerte celular y se mide con un kit estándar (ver Tabla de materiales).
      1. Recoger el sobrenadante por encima de las células después de una incubación de 24 h y diluir a 1:100 utilizando medios estándar.
      2. Inducir la liberación total posible de LDH, que es importante para normalizar todos los valores del paso 2.2.2.1, mediante la adición de 2 μL 10% tritón X-100 a los 100 μL de medios apicales de células control en un transpozo de 24 pocillos. Después de incubar la mezcla de sobrenadante tritón/célula durante 15 minutos a 37 °C, mezclar el medio por encima de las células ahora lisadas y recoger para medir la posible liberación total de LDH.
      3. Una vez recolectados los sobrenadantes, realice el ensayo utilizando las instrucciones estándar del fabricante, midiendo la luminiscencia después de una incubación de 30 minutos utilizando la solución tampón del kit.
        NOTA: Todos los valores de LDH se normalizan a la cantidad total posible de liberación de LDH.
  3. Caracterización del espectro y composición de gránulos similares a lipofuscina
    1. Adquisición de cuantificación y espectros de autofluorescencia
      1. Arregle los cultivos cargados de UAM con PFA al 4% a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de un lavado PBS 5x.
      2. Mantenga una pequeña cantidad de PBS en la cámara apical y luego voltee el Transwell boca abajo. Usando un microscopio de disección y una cuchilla de afeitar, corte la membrana semiporosa del Transwell, aplicando fuerza de corte en la unión de la membrana y Transwell.
        NOTA: Manténgase consistente acerca de qué tan cerca del labio del Transwell se hace el corte, ya que la membrana Transwell tiene una tendencia a deformarse y arrugarse cuando los cortes no son consistentes.
      3. Una vez cortada la membrana Transwell, colóquela inmediatamente en un portaobjetos de microscopio con fórceps, teniendo cuidado de evitar tocar partes de la membrana Transwell con células. Elimine el exceso de PBS con una toallita de tareas, evitando tocar las células. Agregue un soporte de montaje y un cubreobjetos. Asegúrese de hacer un seguimiento de qué lado del Transwell está "con el lado derecho hacia arriba" cuando cubra el Transwell.
      4. Adquiera la intensidad y los espectros autofluorescentes utilizando los mismos ajustes y procedimientos que los pasos 1.3.1.4 y 1.3.1.5.
        NOTA: Al obtener imágenes de UAM, un factor de confusión importante es que los OxOS son autofluorescentes y, a menudo, se adhieren a la superficie apical del EPR durante días y, a veces, incluso semanas después de completar la alimentación con OxOS. Como resultado, al cuantificar UAM, se debe emplear un método para garantizar que la autofluorescencia medida provenga de UAM y no de OxOS. El método más fácil es co-teñir los cultivos de lipofuscina con un anticuerpo de rodopsina. Por ejemplo, el anticuerpo antirodopsina 4D2 se puede utilizar en una dilución 1:1000 y con un protocolo estándar de inmunocitoquímica de fijación de PFA34. El anticuerpo secundario para la rodopsina debe ser un anticuerpo conjugado con colorante rojo lejano (por ejemplo, con un máximo de excitación cercano a 647 nm), ya que la autofluorescencia UAM y OxOS tiende a ser más débil en esta longitud de onda. Las imágenes confocales se pueden adquirir secuencialmente en dos canales, excitando la autofluorescencia UAM y OxOS con un láser de 405 nm y emisión de 415 nm a 550 nm, mientras que la rodopsina residual, que indica OxOS no digerido, se puede excitar con parámetros estándar de imágenes de colorante rojo lejano en un canal separado. Después de la adquisición, el canal de rodopsina se puede usar como una máscara sustractiva en un programa como ImageJ para eliminar la autofluorescencia proveniente de OxOS restante pegajoso, dejando solo la autofluorescencia UAM para cuantificar.
        PRECAUCIÓN: Incluso los sistemas operativos que no están fotooxidados muestran algo de autofluorescencia, e incluso con un lavado riguroso, algunos sistemas operativos y OxOS se adhieren a la superficie del RPE. Por lo tanto, sin generar una máscara sustractiva utilizando inmunotinción de rodopsina, como se sugiere en la NOTA anterior, no es posible cuantificar con precisión los niveles de autofluorescencia UAM en cultivos alimentados con OxOs o SG estándar.
    2. Realizar la detección simultánea de gránulos similares a la lipofuscina y otros marcadores de inmunofluorescencia
      NOTA: Como se detalla en el paso 2.3.1, el amplio espectro de autofluorescencia de la lipofuscina limita las opciones para la cotinción de fluorescencia. Se pueden considerar los siguientes métodos para facilitar la co-tinción.
      1. Utilice un fluoróforo rojo lejano. La autofluorescencia de la lipofuscina es débil en el infrarrojo cercano. Por lo tanto, el uso de un tinte rojo lejano para la detección de fluorescencia de un antígeno de interés, combinado con ajustes cuidadosos de la configuración del canal en un microscopio confocal, generalmente puede distinguir la autofluorescencia de la fluorescencia de tinción conjunta.
      2. Aproveche la larga cola de emisión de fluorescencia de la lipofuscina.
        NOTA: Como la lipofuscina tiene un espectro de emisión de fluorescencia muy amplio, a menudo puede excitarse a una longitud de onda de nm baja (por ejemplo, láser de 405 nm) y aún se detecta una emisión en la parte naranja / roja del espectro (por ejemplo, 585-635nm). Esta combinación única de longitudes de onda de excitación y emisión a menudo se puede adaptar alrededor de otro fluoróforo de tinción conjunta.
        1. Detecte el antígeno de interés utilizando un fluoróforo que tiene un pico de excitación alrededor de 488 nm, con detección de emisiones a 500-530 nm. Configure un canal separado para la detección de autofluorescencia con excitación de 405 nm y emisión de 585-635 nm. Este segundo canal detectará solo UAM, mientras que el primer canal detectará el antígeno de interés más lipofuscina.
        2. Usando un programa de software gratuito como ImageJ, utilice este segundo canal solo UAM como una máscara sustractiva para eliminar la señal UAM del primer canal (que contiene tanto la señal de antígeno como la señal UAM).
      3. Utilice la mezcla espectral. La mayoría de los microscopios confocales modernos contienen una opción de desmezcla espectral. Esto permite adquirir el espectro de una muestra con solo UAM y otra muestra con solo el fluoróforo de co-tinción de interés. La muestra experimental, que contiene tanto UAM como el fluoróforo de co-tinción, puede ser adquirida y sometida a métodos de desmezcla lineal para calcular qué porcentaje de la señal proviene de la autofluorescencia frente a la co-tinción.
        NOTA: Las guías completas para la desmezcla espectral están disponibles con la mayoría de los microscopios confocales modernos.
      4. Utilice imágenes de fluorescencia de por vida. Si bien el espectro de emisión entre UAM y un fluoróforo de co-tinción de interés puede ser similar, es probable que sus vidas de fluorescencia difieran significativamente. En general, UAM demuestra vidas de fluorescencia más cortas que la mayoría de los fluoróforos específicos. Con acceso a un microscopio confocal que permite obtener imágenes de por vida, se pueden bloquear las señales de fluorescencia para detectar aquellas que son más largas que la vida útil típica de la lipofuscina.
        NOTA: En general, la vida útil de la fluorescencia de las señales de más de 2 ns reduce en gran medida la contaminación por UAM, aunque no elimina por completo la señal.
      5. Utilización de un supresor de autofluorescencia. Tradicionalmente, Sudan Black se ha utilizado para apagar la autofluorescencia antes de la tinción específica de inmunofluorescencia35. Varios productos de autofluorescencia eliminadores disponibles comercialmente informan que mejoran los resultados de Sudan Black, y estos productos se detallan en la Tabla de materiales. El enfriamiento de la autofluorescencia, por supuesto, destruirá la capacidad de detectar lipofuscina.
    3. Determinar la composición de gránulos similares a la lipofuscina
      1. Evaluar lípidos neutros
        1. Repare el RPE cargado de UAM y los pocillos de control (alimentados con SG no tratado) en PFA al 4% a temperatura ambiente durante 15 min, y lave con PBS 5x.
        2. Tinción de lípidos neutros usando 10 μg/ml de rojo del Nilo o 3,33 μg/ml de Bodipy 493/503 en una solución de BSA PBS al 3% a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de lavado con PBS durante 5 min 3x.
        3. Recorte y monte Transwell como en los pasos 2.3.1.2 y 2.3.1.3 e imagen. En general, utilice los siguientes anchos de banda de excitación y emisión para la obtención de imágenes: Nile Red - ex 543 nm, em 620-700 nm y Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Evaluar el colesterol esterificado y no esterificado
        1. Siga el paso 2.3.3.1.1
        2. La filipina es un colorante fluorescente que reconoce el colesterol no esterificado, pero no el colesterol esterificado36. Por lo tanto, para evaluar la cantidad de colesterol total (no esterificado y esterificado) en la UAM, primero pre-tratar la muestra con esterasa de colesterol para convertir el colesterol esterificado en colesterol no esterificado. Tratar las células con 20 U/ml de esterasa de colesterol en tampón fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,2) (ver Tabla de materiales) a 37 °C durante 3,5 h, seguido de lavado con PBS durante 5 min 3x.
        3. Manchar con filipina de 50 μg/ml (ver Tabla de materiales) en PBS a temperatura ambiente durante 1 h, y lavar con PBS durante 5 min 3x. Mantenga las muestras cubiertas, lejos de la luz, ya que filipina fotoblanquea fácilmente.
          NOTA: Si sólo se va a cuantificar el colesterol no esterificado, se puede omitir la esterasa de colesterol en el paso 2.3.3.2.2. Si se va a cuantificar la cantidad de colesterol esterificado, se puede deducir por la diferencia entre el colesterol total y el colesterol no esterificado en la muestra.
        4. Recorte y monte Transwell como en los pasos 2.3.1.2 y 2.3.1.3 e imagen.
          NOTA: Al obtener imágenes de filipin, se fotoblanquea muy rápidamente. Uno necesita minimizar la intensidad y la duración de la excitación, y esperar que incluso ocurra algún fotoblanqueo al ver la muestra a través de los oculares. Por lo tanto, al obtener imágenes, uno debe: (1) buscar un área apropiada para obtener imágenes utilizando un canal de fluorescencia que no sea el canal de filipina, (2) obtener imágenes de filipina en un microscopio de campo amplio en lugar de confocal (para limitar la intensidad de la exposición a la luz), y (3) evitar imágenes repetidas de un área. En general, utilice los siguientes anchos de banda de excitación y emisión para obtener imágenes filipina: ex 380 nm, em 480 nm.

3. Evaluación de los efectos de los gránulos similares a la lipofuscina en la fagocitosis del EPR: capacidad consuntiva total

NOTA: La justificación para medir la fagocitosis de SG a través del protocolo de solo pulso de SG a continuación se detalla en la sección de resultados representativos. El método, que se denomina "capacidad consuntiva total", evita las ambigüedades sobre la eficiencia de la fagocitosis que pueden surgir con los ensayos tradicionales de fagocitosis de persecución de pulsos del sistema operativo. Los ensayos se realizan en placas Transwell de 24 pocillos utilizando 50 μL de medios que contienen 4 x 106 OS/mL.

  1. Calcule el número de pocillos necesarios para el experimento y luego descongele una cantidad adecuada de SG regular, gire a 2400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y vuelva a suspender en medios de cultivo celular RPE estándar a 4 x 106 OS/mL. Agregue ligandos puente para facilitar las tasas de fagocitosis.
    NOTA: La concentración final de los ligandos puente en los medios a alimentar las células es de 4 μg/ml para la proteína S y de 1,5 μg/ml para MFG-E8. Como se indica en el paso 1.1.11, puede ser necesario alterar las concentraciones de ligandos puente para otros tipos de EPR o densidades celulares.
  2. Retire los medios apicales y agregue 50 μL 4 x 106 OS/mL, idealmente con concentraciones apropiadas de ligandos puente.
  3. En varias ocasiones después de la adición de SG (p. ej., - 0 h, 1 h, 4 h y 24 h), agregue 16,67 μL 4x tampón de muestra de Laemmli con inhibidores de la proteasa para lisar ambas células y el sobrenadante que contiene SG suprayacente. Use una pipeta P-200 para rayar la superficie de Transwell, teniendo cuidado de no perforar la membrana de Transwell o separar la membrana del Transwell, y recoja el sobrenadante celular combinado más el lisado celular. Vórtice, girar hacia abajo y dejar a temperatura ambiente durante 30 minutos para una desnaturalización completa.
    PRECAUCIÓN: A pesar de usar tampón de muestra para lisar el sistema operativo, no caliente posteriormente la solución de lisis, ya que esto puede desencadenar la agregación de rodopsina. También evite enfriar el sistema operativo lisado hasta que esté listo para el almacenamiento, ya que esto precipitará la proteína. Congelar los lisados no utilizados a -20 °C, asegurándose de que los lisados estén totalmente descongelados antes de su uso.
  4. Ejecute lisados en SDS PAGE utilizando la misma configuración que en el paso 1.3.3, cargando volúmenes iguales de lisados por pocillo. GAPDH, β-actina u otra proteína de mantenimiento deben usarse para normalizar el número de células, ya que las tasas de fagocitosis dependen del número de células.
  5. Probe Western blots con anticuerpos contra el extremo N o C de la rodopsina. Use condiciones estándar de Western blotting, y las diluciones de anticuerpos se enumeran en la Tabla de materiales.
    NOTA: Debajo de la banda principal de rodopsina, habrá múltiples fragmentos de rodopsina. Estos fragmentos representan rodopsina parcialmente digerida, un proceso que comienza antes de la fusión del fagosoma con el lisosoma32,33. Un aumento en el número de fragmentos de rodopsina en el EPR cargado de UAM en comparación con el EPR de control podría indicar un defecto aguas abajo en la capacidad del fagolisoma, a nivel de fusión fagosoma-lisosoma, acidificación lisosomal y/o función enzimática degradativa 16,34,35.

Resultados

La configuración para la fotooxidación de la SG se demuestra en la Figura 1Ai. Los portaobjetos recubiertos de politetrafluoroetileno permiten cargar un gran volumen de OS en solución por rectángulo abierto sin extenderse por el resto del portaobjetos. El portaobjetos con OS está contenido dentro de una placa de Petri estéril con la tapa apagada, y se coloca una lámpara UV sobre el portaobjetos como se muestra en la Figura 1Aii. Alternativamente, la diapo...

Discusión

Si bien la lipofuscina RPE se ha estudiado durante décadas, su toxicidad se debate 2,9,16,42. Dada la ambigüedad sobre la toxicidad de la lipofuscina de modelos animales11, los modelos in vitro que utilizan EPR humano son valiosos. Se ha descrito una gama de modelos de acumulación de lipofuscina in vitro, pero ninguno ha utilizado tanto la alimentaci...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado, en parte, por subvenciones de la Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) y la International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. cuenta actualmente con el apoyo de una subvención K08 del Instituto Nacional del Ojo (EY033420). No se utilizaron fondos federales para la investigación de HFT. El apoyo adicional proviene de la Iniciativa James Grosfeld para la DMAE seca y los siguientes donantes privados: Barbara Dunn y Dee & Dickson Brown.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishCorning#353003Others also work
24-well TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antibodyCell Signaling Technology#4801S1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4Abcam#54171:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencherBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencherVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Cholesterol esterase Life TechnologiesFrom A12216 kit
Confocal microscopeLeicaLeica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinasW. L. Lawson CompanyDark-adapted bovine retinas (pre-dissected)Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Flow cytometerThermo FisherAttune NxT
Flow cytometer analysis software BDFlowJo
Handheld UV light Analytik Jena USUVGL-55
Human MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Human purified Protein SEnzyme Research LaboratoriesHPS
Laemmli sample bufferThermo FisherJ60015-AD
LDH assayPromegaJ2380LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting mediaInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reagent
Nile redSigma-Aldrich#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slidesTekdonCustomizedCustomized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors Cell Signaling Technology#5872
Protein assayBio-Rad#5000122 RC DC protein assay
TEER electrodeWorld Precision InstrumentsSTX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meterWorld Precision InstrumentsEVOM3
Ultraviolet crosslinker deviceAnalytik Jena USUVP CL-1000

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