Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Resumen

El estudio in vitro de la diferenciación de adipocitos blancos, marrones y beige permite la investigación de las funciones autónomas celulares de los adipocitos y sus mecanismos. Las líneas celulares de preadipocitos blancos inmortalizados están disponibles públicamente y se usan ampliamente. Sin embargo, la aparición de adipocitos beige en el tejido adiposo blanco en respuesta a señales externas es difícil de recapitular en toda su extensión utilizando líneas celulares de adipocitos blancos disponibles públicamente. El aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino se ejecuta comúnmente para obtener preadipocitos primarios y realizar la diferenciación de adipocitos. Sin embargo, la picada y la digestión de la colagenasa del tejido adiposo a mano pueden dar lugar a variaciones experimentales y son propensas a la contaminación. Aquí, presentamos un protocolo semiautomatizado modificado que utiliza un disociador de tejido para la digestión de colagenasa para lograr un aislamiento más fácil del SVF, con el objetivo de reducir la variación experimental, reducir la contaminación y aumentar la reproducibilidad. Los preadipocitos obtenidos y los adipocitos diferenciados pueden ser utilizados para análisis funcionales y mecanicistas.

Introducción

La biología del tejido adiposo ha estado atrayendo una atención cada vez mayor debido a la creciente prevalencia de obesidad y diabetes tipo 2 a nivel mundial¹. Los adipocitos almacenan el exceso de energía en forma de gotas de lípidos, que se liberan al morir de hambre. Además, el tejido adiposo mantiene la homeostasis energética sistémica al servir como órgano endocrino y comunicarse con otros tejidos ^2,3. Curiosamente, tanto el exceso de tejido adiposo (obesidad) como la pérdida adiposa (lipodistrofia) están relacionados con la resistencia a la insulina y la diabetes

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Tokio y realizados de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Tokio.

1. Preparación de la solución enzimática y el medio

1. Coloque ambos lados del tejido adiposo blanco inguinal (lado derecho e izquierdo, aproximadamente 150 mg) de un ratón de 7-8 semanas de edad y 2,5 ml de solución enzimática en el tubo C del disociador.
2. Reconstituir la enzima D con 3 ml de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 sin suero....

Discusión

Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de la SVF del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y realizar la diferenciación de adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de colagenasa disminuyó la variación experimental, disminuyó el riesgo de contaminación y aumentó la reproducibilidad. Si bien este procedimiento es un paso crítico dentro del protocolo presentado, el proceso está altamente automatizado y no se necesita optimización. Sin embargo, depen.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056