Perfusión sanguínea rápida y efectiva en Xenopus

Resumen

Aquí se presenta un protocolo efectivo de perfusión sanguínea rápida para preparar muestras de tejido de ranas con garras africanas para estudios de transcriptómica y proteómica.

Resumen

Xenopus ha sido poderosos organismos modelo para comprender el desarrollo y la enfermedad de los vertebrados durante más de 100 años. Aquí, se define un protocolo de perfusión sanguínea rápida en Xenopus, dirigido a una reducción consistente y drástica de la sangre dentro de todos los tejidos. La perfusión se lleva a cabo insertando una aguja directamente en el ventrículo del corazón y bombeando solución salina tamponada con fosfato heparinizado (PBS) a través del sistema vascular. El procedimiento se puede completar en aproximadamente 10 minutos por animal. La sangre está dominada por unas pocas proteínas y tipos de células muy abundantes, creando numerosos problemas ya que estas proteínas enmascaran la mayoría de las otras moléculas y tipos de células de interés. La caracterización reproducible de tejidos adultos de Xenopus con proteómica cuantitativa y transcriptómica unicelular se beneficiará de la aplicación de este protocolo antes del muestreo de órganos. Los protocolos para el muestreo de tejidos se definen en documentos complementarios. Estos procedimientos están dirigidos a la estandarización de prácticas en Xenopus de diferente sexo, edad y estado de salud, específicamente X. laevis y X. tropicalis.

Introducción

La perfusión de todo el cuerpo de los anfibios se completa rutinariamente con fines de preservación y fijación 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos procedimientos ocurren a una velocidad que limita el número de muestras frescas que se pueden tomar por animal. El objetivo de este trabajo es desarrollar un protocolo efectivo de perfusión sanguínea en Xenopus, priorizando la velocidad de la técnica. El protocolo toma menos de 10 min por animal para X. tropicalis y menos de 15 min por X. laevis animal. Las prioridades secundarias son la facilidad de replicación y el uso de equipos fáciles de adquirir para que las muestras de alta calidad puedan compartirse ampliamente entre los laboratorios Xenopus.

Las ranas Xenopus se utilizan ampliamente en la investigación biomédica para estudiar procesos biológicos y patológicos fundamentales conservados en todas las especies. Este tetrápodo tiene una relación evolutiva más cercana con los mamíferos que otros modelos acuáticos, con pulmones, un corazón de tres cámaras y extremidades con dedos. La comunidad internacional utiliza eficazmente Xenopus para obtener una comprensión más profunda de las enfermedades humanas a través de modelos de enfermedades en profundidad y análisis moleculares de la función génica relacionada con la enfermedad. Las numerosas ventajas de Xenopus como modelo animal los convierten en herramientas invaluables para estudiar las bases moleculares del desarrollo humano y la enfermedad; Estas ventajas incluyen: gran tamaño de ovocitos y embriones, alta fecundidad, facilidad de alojamiento, rápido desarrollo externo y facilidad de manipulación genómica. Se ha estimado que Xenopus comparte ~ 80% de los genes identificados de enfermedades humanas⁷.

En comparación con los modelos populares de mamíferos, Xenopus es un modelo rápido y rentable, con la facilidad de eliminación de morfolinos y la disponibilidad de transgénicos eficientes y mutaciones genéticas dirigidas utilizando CRISPR⁸. La espectrometría cuantitativa de masas y la transcriptómica unicelular se han aplicado con éxito a embriones de Xenopus^9,10, pero un atlas celular reciente de Xenopus laevis muestra que la composición de la mayoría de los tejidos está dominada por los tipos de células sanguíneas ¹¹. Al desarrollar una técnica que exangüe el tejido a un ritmo rápido y utilizando medios refrigerados, la frescura de la muestra se ve mínimamente afectada por la perfusión. Esto es particularmente importante para aplicaciones donde el objetivo es perfilar la expresión de ARNm o proteína fisiológicamente imperturbable.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las reglas y regulaciones de la Escuela de Medicina de Harvard IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales) (IS 00001365_3).

NOTA: Aunque el método primario de eutanasia descrito es considerado una técnica aceptable para la eutanasia por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria¹², no se ha encontrado que conduzca al cese de un latido cardíaco¹³. Incluso el método secundario de doble picadura utilizado con frecuencia no evita esto, ni tampoco la eliminación del corazón del animal. La exanguinación de animales anestesiados se considera un método humano y eficaz para el éxito de la eutanasia¹². Como mantener tejidos frescos a través de la eutanasia es el objetivo de este protocolo, es beneficioso que el corazón continúe latiendo a través de la eutanasia primaria con MS-222, y que la perfusión sea en sí misma un método de eutanasia secundaria a través de la exanguinación.

1. Preparación

1. Asegúrese de que la institución de investigación ha aprobado la técnica de eutanasia y perfusión descrita en este protocolo.
2. Preparar una solución de 5 g/L MS-222 (metanosulfonato de tricaína) y 5 g/L de bicarbonato de sodio. El volumen debe ser mayor que el volumen requerido para cubrir completamente a los animales sacrificados. Compruebe el pH para asegurarse de que es ≥7.
3. Preparar 500 μL de 180 U/ml de heparina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) por X. laevis, o 200 μL por X. tropicalis.
4. Realizar la eutanasia primaria colocando el Xenopus en esta solución (a partir del paso 1.2); El animal permanecerá sumergido durante un total de 1 h.
5. Confirme que el Xenopus ha perdido su respuesta al dolor pellizcando el pie 15 minutos en la eutanasia. Si el animal es reactivo, devuélvalo a la solución de eutanasia hasta que se pierda esta respuesta.
6. Pesar el Xenopus y tomar las medidas adicionales necesarias antes del muestreo.
7. Con una aguja de 31 G, inyecte X. laevis con 250 μL y X. tropicalis con 100 μL de heparina de 180 U/ml en PBS (desde el paso 1.3) en la musculatura de cada extremidad anterior.
8. Preparar una solución de 1 mL/g del peso animal de 54 U/mL de heparina en perfusión PBS. Las personas con más experiencia con este protocolo pueden encontrar que se requieren menos medios para completar la perfusión.
9. Use una aguja hipodérmica de 22 G para perfundir X. laevis y una aguja hipodérmica de 25 G para X. tropicali. Embelle la aguja de perfusión recortando la punta con cortadores de alambre (Figura 1)¹⁴.
   NOTA: Esto reduce la probabilidad de que la aguja perfore a través del ventrículo si se desplaza. Además de embotarse, la aguja puede ser molida ligeramente hacia abajo con una piedra de afilar o lima, pero aún así permanece lo suficientemente afilada como para perforar el ventrículo.
10. Prepare la bomba colocando la aguja recortada y haciendo circular 54 U/ml de perfusión heparinizada de PBS (a partir del paso 1.8). Asegúrese de purgar todas las burbujas de aire del tubo para eliminar la posibilidad de embolia de aire, lo que conduce a una disminución de la eficiencia o falla de la perfusión (ver Tabla 1). Mantenga los medios de perfusión en hielo durante la duración del procedimiento.
11. Si la bomba no es programable, con la aguja en su lugar, mida el volumen bombeado de medios bajo los diferentes ajustes para determinar qué ajustes son los más cercanos a 5 mL/min y 10 mL/min. Estos caudales se utilizarán independientemente de la especie. Si la bomba de perfusión es programable, calibre con la aguja en su lugar, siguiendo las instrucciones del fabricante.
12. Coloque la superficie de disección (bandeja o lámina de espuma) en una inclinación dentro de un recipiente secundario, o colóquela para facilitar el drenaje de la sangre.
13. Una vez que la rana ha estado en la solución durante 1 h, se ha completado la eutanasia primaria. Retire la rana y vuelva a verificar la pérdida de respuesta al dolor realizando un pellizco en el pie.
14. Coloque la rana sobre su espalda y fije cada extremidad (Figura 2). Si se requiere preservar el tejido de las extremidades, se pueden colocar alfileres delgados a través de los dedos o grapas en forma de U alrededor de las extremidades.
15. Usando tijeras de disección, corte a través de la piel, hasta la línea media, y luego lateralmente, haciendo dos colgajos. (Figura 2)
16. Use fórceps para agarrar la línea alba y alejarla de la cavidad celómica (Figura 3). Use cuidadosamente tijeras para cortar a través de la musculatura. Haga dos solapas fuera de la pared de la cavidad y corte o fije todas las solapas fuera del camino.
17. Use tijeras de disección para cortar a través de los huesos coracoides y cortar el exceso de tejido para obtener un mejor acceso al corazón (Figura 3).
18. El corazón todavía debería estar latiendo. Si el corazón ha dejado de latir antes de la perfusión, tenga en cuenta que la frescura de la muestra se ha visto comprometida.

2. Perfusión

1. Identifique el estómago y desplácelo suavemente para que esté en la parte superior del lóbulo izquierdo del hígado (a la derecha del espectador), con su vasculatura visible durante la duración del procedimiento. Identifique un pulmón y agárrelo por su punta con pinzas de tejido. Tire del pulmón fuera de la cavidad celómica y fíjelo a través de la punta (Figura 4). Haga esto suavemente, ya que los vasos sanguíneos rotos no se perfunden bien. Tenga en cuenta si la sangre es visible dentro del lóbulo, ya que esto afectará la capacidad de determinar la finalización del procedimiento.
2. Tome una imagen de la cavidad celómica para evaluar mejor la eficiencia de la perfusión y potencialmente identificar tejidos anormales en una fecha posterior.
3. Identifique el pericardio delgado y tire de él enseñado con pinzas de tejido (Figura 5). Perforar suavemente el pericardio con la punta de las tijeras de iridectomía, teniendo cuidado de no cortar los tejidos subyacentes. Despegue el pericardio lejos de las tres cámaras del corazón.
4. Use fórceps para agarrar suavemente el ventrículo por su ápice. Aplique una presión limitada para que haya suficiente espacio entre las superficies de tracción de las pinzas para que pase la aguja de perfusión (Figura 6).
5. Inserte la aguja a través del cierre de los fórceps en la cámara del ventrículo, teniendo cuidado de no perforar a través del ventrículo (Figura 7). Sujete las pinzas de tejido en su lugar con un soporte de aguja usando un hemostático.
   NOTA: Esta técnica estabiliza la posición de la aguja, que todavía está afilada. Sujetar la aguja directamente al ventrículo también causará daños innecesarios, lo que dificultará la recuperación en caso de que sea necesario (ver Tabla 1).
6. Arranque el flujo de la bomba a aproximadamente 5 mL/min. Las tres cámaras del corazón y el tronco arterial se hincharán (Figura 8; ver Tabla 1).
7. Con tijeras, lance con cuidado la aurícula derecha (a la izquierda del espectador); La sangre se derramará. Ajuste el caudal a 5 mL/min o auméntelo a 10 mL/min.
8. Continúe hasta que la vasculatura del estómago se blanquee (ver Tabla 1), luego lance la aurícula izquierda del corazón (a la derecha del espectador). Si el caudal sigue siendo de 5 ml/min, auméntelo a aproximadamente 10 ml/min.
9. Use una pipeta de transferencia para enjuagar la cavidad celómica en medios de perfusión, para ayudar a mantener la visibilidad y evaluar mejor el color del perfusión que fluye de las aurículas.
10. Mantenga la aguja en su lugar hasta que el perfusión que fluye de las aurículas esté claro (ver Tabla 1) y el pulmón haya perdido su tono rojo (ver Tabla 1; Figura 9).

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Resultados

Después de una perfusión exitosa, todos los tejidos (excluyendo el hígado en Xenopus pigmentado) serán claramente más ligeros y menos saturados de sangre. Los vasos sanguíneos principales se volverán menos notables (Figura 10), y los tejidos (excluyendo el hígado) se enjuagarán limpiamente en el tampón después de ser muestreados. Si bien la ejecución exitosa del protocolo solo puede confirmarse en última instancia por la calidad de los datos de muestras de tejido exsang...

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Discusión

Este protocolo describe las técnicas tradicionales de disección para acceder a la cavidad celómica. Otras técnicas también son aceptables, siempre que causen un daño mínimo a los tejidos, el corazón sea accesible y el pulmón y el estómago sean visibles. Del mismo modo, la mayoría de las herramientas de disección enumeradas se pueden sustituir fácilmente con elementos comparables.

Si bien se han hecho intentos para optimizar la eficacia de este procedimiento, los resultados pueden ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP