Una técnica tridimensional para la visualización de cambios ultraestructurales mitocondriales en células de cáncer de páncreas

Resumen

Este protocolo describe cómo reconstruir las crestas mitocondriales para lograr imágenes 3D con alta precisión, alta resolución y alto rendimiento.

Resumen

Comprender las características dinámicas de la ultraestructura del orgánulo celular, que no solo es rica en información desconocida sino también sofisticada desde una perspectiva tridimensional (3D), es fundamental para los estudios mecanicistas. La microscopía electrónica (EM) ofrece una buena profundidad de imagen y permite la reconstrucción de pilas de imágenes de alta resolución para investigar la morfología ultraestructural de los orgánulos celulares incluso a escala nanométrica; por lo tanto, la reconstrucción 3D está ganando importancia debido a sus ventajas incomparables. La microscopía electrónica de barrido (SEM) proporciona una tecnología de adquisición de imágenes de alto rendimiento que permite reconstruir grandes estructuras en 3D a partir de la misma región de interés en cortes consecutivos. Por lo tanto, la aplicación de SEM en la reconstrucción 3D a gran escala para restaurar la verdadera ultraestructura 3D de los orgánulos es cada vez más común. En este protocolo, sugerimos una combinación de técnicas seriadas de corte ultrafino y reconstrucción 3D para estudiar las crestas mitocondriales en células de cáncer de páncreas. Los detalles de cómo se realizan estas técnicas se describen en este protocolo paso a paso, incluido el método de osmio-tiocarbohidrazida-osmio (OTO), la obtención de imágenes de sección ultrafina en serie y la visualización de la pantalla.

Introducción

Las mitocondrias son uno de los orgánulos más importantes de la célula. Sirven como eje central de la bioenergética celular y el metabolismo ^1,2 y desempeñan un papel fundamental en el cáncer³. El cáncer de páncreas (CP) es uno^{de los} cánceres más difíciles de tratar debido a su rápida propagación y alta tasa de mortalidad. La disfunción mitocondrial, que es causada principalmente por cambios en la morfología mitocondrial 3,5,6,7^, se ha relacionado con los mec....

Protocolo

1. Preparación del material

1. Cultivar 2 x 10⁶ células Panc02 en 12 mL de medio DMEM (10% de suero fetal bovino y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), y mantener a 37 °C y 95% de humedad en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire durante 48 h.
2. Recoja las células de Panc02, centrifugue a 28 x g durante 2 minutos y luego deseche el sobrenadante. Asegúrese de que la muestra tenga un tamaño adecuado (1 x 10⁷ células), ya que de lo contrario, los siguientes pasos de fijación y deshidratación no funcionarán bien.
3. Añadir 1 mL de glutaraldehído al 2,5% como fijador para fijar las cé....

Resultados

Durante el cultivo celular (Figura 1A), primero dividimos las células de cáncer de páncreas en un grupo control cultivado con medio de cultivo completo, un grupo (1S,3R)-RSL3⁴⁸ (RSL3, un activador de la ferroptosis, 100 nM) y un grupo RSL3 (100 nM) más ferrostatina-1⁴⁹ (Fer-1, un inhibidor de la ferroptosis, 100 nM). A través de los pasos experimentales anteriores, el microscopio electrónico de barrido adquirió 38 (Figura suplementaria 1.......

Discusión

El método que aquí se presenta es una guía útil paso a paso para aplicar la técnica de reconstrucción 3D, que implica la aplicación de microscopía electrónica y tecnología de procesamiento de imágenes al apilamiento y segmentación de imágenes tomográficas 2D generadas a partir de secciones ultrafinas en serie. Este protocolo pone de relieve una limitación de las imágenes 2D que puede abordarse mediante la visualización en 3D de la ultraestructura del orgánulo, que tiene las ventajas de una fuerte reprod.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2