Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos

Resumen

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

Resumen

Los neutrófilos son conocidos como una de las primeras líneas de defensa en la respuesta inmune innata y pueden realizar muchas funciones celulares particulares, como la quimiotaxis, la migración inversa, la fagocitosis, la degranulación de enzimas y metabolitos citotóxicos y la liberación de ADN como trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmunológico. Dado que los neutrófilos frescos están diferenciados terminalmente, son de corta duración y muy variables entre los individuos, es importante aprovechar al máximo las muestras recogidas. A menudo, los investigadores necesitan realizar ensayos de detección para evaluar una visión general de las muchas funciones de los neutrófilos que pueden verse afectadas por afecciones específicas que se están evaluando. Para abordar esta necesidad se desarrolló un conjunto de pruebas que seguían un único proceso de aislamiento de neutrófilos de densidad normal, buscando un equilibrio entre velocidad, exhaustividad, coste y precisión. Los resultados se pueden utilizar para razonar y guiar estudios de seguimiento en profundidad. Este procedimiento se puede llevar a cabo en un tiempo promedio de 4 h e incluye la evaluación de la viabilidad celular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la migración en tiempo real y la fagocitosis de levaduras en portaobjetos de vidrio, dejando suficientes células para enfoques más detallados como estudios ómicos. Además, el procedimiento incluye una forma de observar fácilmente una sugerencia preliminar de NETs después de una tinción panóptica rápida observada por microscopía óptica, con una falta de marcadores específicos, aunque lo suficiente como para indicar si valdría la pena realizar más esfuerzos en ese sentido. La diversidad de funciones probadas combina puntos comunes entre las pruebas, reduciendo el tiempo y los gastos de análisis. El procedimiento se denominó NeutroFun Screen, y aunque tiene limitaciones, equilibra los factores antes mencionados. Además, el objetivo de este trabajo no es un conjunto de pruebas definido, sino más bien una guía que se pueda ajustar fácilmente a los recursos y demandas de cada laboratorio.

Introducción

Los neutrófilos son las células inmunitarias innatas más abundantes en la sangre humana y se sabe que desempeñan un papel importante en la infección y la inflamación, siendo los primeros en responder al sitio del daño tisular^. En los últimos años, ha habido un creciente reconocimiento del papel crucial que desempeñan los neutrófilos en una variedad de enfermedades y en el apoyo a la homeostasis². Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmune ^3,4,5

Protocolo

Todos los experimentos siguieron estrictamente las directrices éticas establecidas por el comité de revisión institucional de la Universidad de Brasilia (proceso 13364819.0.0000.5558), y las muestras fueron identificadas por códigos para garantizar el anonimato de los donantes. Las células se obtuvieron de donantes masculinos sanos normales de entre 18 y 35 años, que firmaron el consentimiento informado y cumplieron con los siguientes criterios de elegibilidad: no fumadores/vapeadores, sin condiciones de salud crónicas y sin antecedentes de afecciones inflamatorias en los últimos 14 días.

1. Extracción de sangre

1. C....

Discusión

Los neutrófilos son células altamente dinámicas y receptivas que tienen una vida corta y aún no pueden ser criopreservadas¹⁹, lo que dificulta las investigaciones sobre su biología. Por lo tanto, es esencial seguir pasos cuidadosos para obtener neutrófilos viables, enriquecidos y en reposo^11,20. En este estudio se empleó una técnica de aislamiento basada en la densidad que enfatiza la manipulación suave y mínima, así como el uso.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma - Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma - Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma - Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma - Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma - Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma - Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma - Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma - Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software