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  • Materiales
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Resumen

Este protocolo describe la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar genes de interés en el genoma nuclear de la microalga verde Chlorella vulgaris, lo que conduce a la producción de transformantes estables.

Resumen

La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) sirve como una herramienta ampliamente empleada para manipular los genomas de las plantas. Sin embargo, A. tumefaciens exhibe la capacidad de transferencia génica a una amplia gama de especies. Numerosas especies de microalgas carecen de métodos bien establecidos para integrar de forma fiable genes de interés en su genoma nuclear. Para aprovechar los beneficios potenciales de la biotecnología de microalgas, es crucial contar con herramientas de manipulación genómica sencillas y eficientes. En este trabajo, se presenta un protocolo de AMT optimizado para la especie de microalga industrial Chlorella vulgaris, utilizando la proteína fluorescente verde reportera (mGFP5) y el marcador de resistencia a antibióticos para la higromicina B. Los mutantes se seleccionan mediante siembra en medios de tris-acetato-fosfato (TAP) que contienen higromicina B y cefotaxima. La expresión de mGFP5 se cuantifica a través de la fluorescencia después de más de diez generaciones de subcultivo, lo que indica la transformación estable del casete de ADN-T. Este protocolo permite la generación confiable de múltiples colonias transgénicas de C. vulgaris en menos de dos semanas, empleando el vector de expresión vegetal pCAMBIA1302 disponible comercialmente.

Introducción

Agrobacterium tumefaciens, una bacteria gramnegativa transmitida por el suelo, posee una capacidad única de transferencia de genes entre reinos, lo que le valió el título de "ingeniero genético natural"1. Esta bacteria puede transferir ADN (ADN-T) de un plásmido inductor de tumores (Plásmido Ti) a las células huésped a través de un sistema de secreción de tipo IV, lo que resulta en la integración y expresión del ADN-T dentro del genoma del huésped 1,2,3,4. En el entorno natural, este proceso conduce a la formación de tumores en las plantas, comúnmente conocida como enfermedad de la agalla de la corona. Sin embargo, Agrobacterium también puede transferir ADN-T a otros organismos, como levaduras, hongos, algas, embriones de erizo de mar e incluso células humanas en condiciones de laboratorio 5,6,7,8.

Aprovechando este sistema natural, la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) permite la integración aleatoria de genes de interés en el genoma nuclear de una célula huésped mediante la modificación de la región de ADN-T del plásmido Ti. Para este propósito, un vector de expresión de plantas AMT ampliamente utilizado es pCAMBIA13029. Los investigadores pueden emplear flujos de trabajo de clonación simples en E. coli antes de transferir el vector deseado a A. tumefaciens para su posterior transferencia al huésped de interés.

Las microalgas verdes son eucariotas que comparten muchas similitudes con las plantas terrestres, pero son muy recalcitrantes a la modificación genética. Sin embargo, la transformación genética desempeña un papel crucial tanto en la investigación fundamental como en la biotecnológica de las microalgas. En varias especies de microalgas, en particular Chlamydomonas reinhardtii, la transformación genética a través de AMT ha introducido con éxito transgenes como la interleucina-2 humana (hIL-2), el dominio de unión al receptor 2 del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2 RBD) y dos péptidos antimicrobianos (AMP)10,11,12,13. Entre ellas, Chlorella vulgaris, una especie de alga verde menos exigente y de rápido crecimiento, tiene un potencial significativo para la producción sostenible de carbohidratos, proteínas, nutracéuticos, pigmentos y otros compuestos de alto valor14. Sin embargo, la falta de herramientas confiables para crear cepas transgénicas de C. vulgaris obstaculiza su progreso comercial. Dado que solo ha habido un número limitado de trabajos publicados que utilizan AMT en C. vulgaris15, y dadas las considerables diferencias entre el cultivo de plantas y microalgas, la optimización del protocolo AMT se vuelve esencial.

En este estudio, los investigadores insertaron la proteína verde fluorescente (mGFP5) aguas abajo del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CamV) y agregaron una etiqueta de histidina para usarla como gen reportero para la expresión de proteínas. Los transformantes se seleccionaron utilizando higromicina B, y después de un subcultivo durante más de veinte generaciones, la transformación se mantuvo estable. El plásmido pCAMBIA1302 empleado en este trabajo se puede adaptar fácilmente para contener cualquier gen de interés. Además, el método y los materiales presentados se pueden ajustar para otras especies de algas verdes con un promotor activo CamV35S, ya que este promotor se utiliza para la selección de higromicina.

Protocolo

Todos los medios y soluciones deben esterilizarse en autoclave antes de su uso, a menos que se indique lo contrario. Todos los tubos de centrífuga, puntas de pipeta, etc., deben ser estériles o esterilizados en autoclave antes de su uso. Para facilitar la referencia, las recetas de medios utilizadas en este protocolo se enumeran en la Tabla 1.

1. Preparación de células electrocompetentes de A. tumefaciens

  1. Inocular Agrobacterium (AGL-1) en un matraz agitador estéril de 25 ml de medios LB (suplementado con rifampicina, 20 mg/L-1) a partir de una reserva de glicerol congelada y crecer durante la noche a 28-30 °C y 150 rpm.
    NOTA: La cepa AGL-1 de Agrobacterium es (ver Tabla de Materiales) resistente a la rifampicina, ampicilina, cloranfenicol y estreptomicina y se puede obtener de varios proveedores.
  2. Al día siguiente, diluir el cultivo 1,00,000 veces agregando 0,5 μL del cultivo durante la noche a 50 ml de agua ultrapura esterilizada en autoclave y esparcir 10 μL de este cultivo diluido en una placa LB, y luego incubar a 28-30 °C durante 1-3 días.
  3. Elegir una colonia e iniciar un cultivo nocturno de 20 mL en LB con rifampicina a 28-30 °C.
  4. Al día siguiente, inocular 500 mL de medio LB (sin antibiótico) en un matraz agitador con 9 mL del cultivo nocturno y crecer a 28-30 °C hasta que el DO600 alcance 0,5.
  5. Divida el cultivo uniformemente en diez tubos de centrífuga de 50 ml y enfríe en hielo durante 30 minutos. Enfriar previamente la centrífuga a 4 °C.
  6. Centrifugar los tubos a 4 °C y 4000 x g durante 15 min. Posteriormente, retire la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el gránulo en cada tubo en 50 ml de agua helada.
  7. Centrifugar las células a 4 °C y 4000 x g durante 15 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml de agua helada en cada tubo.
  8. Centrifugar las células a 4 °C y 4000 x g durante 15 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de glicerol helado al 10% (p/v) en cada tubo.
  9. Combine todos los tubos en un tubo de 50 ml y centrifugue las células a 4 °C y 4000 x g durante 15 min. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 400 μL de glicerol al 10% (p/v) helado. La concentración celular debe ser de aproximadamente 1-3 x 1010 células/mL.
  10. Distribuya las células como alícuotas de 50 μL en microtubos estériles preenfriados. Congelar en nitrógeno líquido y conservar en un congelador a -80 °C.

2. Electroporación de A. tumefaciens

  1. Añadir 50 μL de células electrocompetentes AGL-1 A. tumefaciens en una cubeta preenfriada de 0,1 mm y añadir 2 μL de pCAMBIA1302 o plásmido similar (conc 15 ng/μL) (ver Tabla de Materiales).
  2. Electroporar a 2400 V usando un electroporador (200 Ω, extensor de capacitancia 250 μFD, capacitancia 25 μFD, decaimiento exponencial, ver Tabla de Materiales). La constante de tiempo debe ser de >4,5 ms para una electroporación exitosa con decaimiento exponencial.
  3. Agregue inmediatamente 1 ml de medio LB a la cubeta y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Transfiera 1 ml de células resuspendidas a un microtubo de 1,5 ml e incube a 28-30 °C durante al menos 1 h para recuperarse.
  4. Coloque las células en agar LB que contenga el antibiótico apropiado (es decir, 50 mg/L de kanamicina para pCAMBIA1302 para la selección procariota).
  5. Incubar a 28-30 °C durante 2-3 días.
  6. Seleccione una colonia, cultive durante la noche en LB con la selección adecuada (50 mg/L de kanamicina para pCAMBIA1302) y criopreserva la cepa que contiene plásmidos utilizando glicerol al 50% a -80 °C para su uso futuro.

3. AMT de C. vulgaris

NOTA: Prepare los cultivos de C. vulgaris (UTEX 395, ver Tabla de Materiales) y A. tumefaciens en paralelo para el co-cultivo. Los cultivos de C. vulgarideben iniciarse 3 días antes de preparar los cultivos de A. tumefaciens. El protocolo fue modificado con base en lo publicado por Kumar et al.7.

  1. Preparar el cultivo de C. vulgaris
    1. C. vulgaris se almacena tradicionalmente en oblicuas o se mantiene en cultivos de fase logarítmica en condiciones de iluminación. A partir de un cultivo en fase logarítmica a DO600 = 1,0, extender 0,5 mL sobre una placa de agar de acetato de tris-fosfato (TAP, ver Tabla 1) ( 1,2% p/v agar A) y crecer durante 5 días a 25 °C con iluminación (50 μE/m2s). Esto producirá aproximadamente 5 x 106 celdas.
  2. Preparar el cultivo de A. tumefaciens
    1. Cultive la cepa de A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 en un matraz agitador inoculando 10 mL de medio LB suplementado con 15 mM de glucosa, 20 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de kanamicina (ver Tabla de Materiales) utilizando el caldo de glicerol. Incubar a 28-30 °C y 250 rpm durante la noche.
    2. Inocular 1 mL de cultivo durante la noche en 50 mL de LB con 15 mM de glucosa, 20 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de kanamicina e incubar a 28-30 °C y 250 rpm hasta que el OD600 alcance 1,0.
  3. Cocultivar C. vulgaris y A. tumefaciens
    1. Para preparar el cultivo de A. tumefaciens para el cocultivo, transfiera el cultivo cultivado a un tubo de 50 ml y centrifugue a 4000 x g durante 30 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante con una pipeta y lave las células dos veces con el medio de inducción.
      NOTA: El medio de inducción utilizado es un medio TAP ajustado a pH 5,5 y suplementado con metales traza medios F/2 y vitaminas con 200 μM de acetosiringona (AS, ver Tabla de Materiales). Vuelva a suspender las células en medios de inducción de modo que OD600 = 0,5.
    2. Para preparar el cultivo de C. vulgaris para el cocultivo, agregue 25 mL de medio de inducción a la placa de C. vulgaris que contiene ~ 5 x 106 células. Transfiera a un tubo de 50 ml. Centrifugar las células a 4000 x g durante 15 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
    3. Mezclar el gránulo de células de algas con 200 μL de la suspensión bacteriana (OD600: 0,5) e incubarlos en un agitador rotativo a 21-25 °C a 150 rpm durante 1 h.
    4. Extender el cultivo mixto (200 μL) en placas de inducción suplementadas con 15 mM de glucosa e incubar a 21-25 °C en la oscuridad durante 3 días.
    5. Después de 3 días, use 10 mL de medio TAP suplementado con 400 mg/L de cefotaxima o 20 mg/L de tetraciclina (ver Tabla de Materiales) para recolectar las microalgas e incubar en la oscuridad a 21-25 °C durante 2 días para eliminar A. tumefaciens del cultivo.
    6. Colocar 500 μL del cultivo en un medio selectivo, p. ej., medio TAP suplementado con 20-70 mg/L de higromicina B (cuando se utiliza pCAMBIA1302) y 400 mg/L-1 de cefotaxima o 20 mg/L de tetraciclina. Incubar a 21-25 °C en la oscuridad durante 2 días antes de colocarlos en una cámara iluminada.
      NOTA: Las colonias resistentes aparecerán de 5 a 7 días después de la exposición a la luz.
    7. Recoger colonias individuales de la placa de transformación y volver a enrasarlas en placas de agar TAP suplementadas con 400 mg/L de cefotaxima o 20 mg/L de tetraciclina y 20-70 mg/L de higromicina B.

4. PCR de colonias (cPCR) para confirmar la integración génica en transformantes de C. vulgaris

  1. Extraer ADN genómico de un transformante de C. vulgaris después de subcultivar al menos dos veces de una sola colonia utilizando un kit de extracción de ADN genómico de plantas (ver Tabla de Materiales). Usando esto como plantilla para la PCR, diseñe cebadores para la región mgfp5 del ADN-T (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', y M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. Utilizando un kit de mezcla maestra de ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (ver Tabla de materiales), realice la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para validar la integración del transgén.
      NOTA: Para el presente estudio se utilizaron las siguientes condiciones: 98 °C durante 3 min; 35 ciclos (98 °C durante 10 s, 57 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 min); 72 °C durante 5min. Utilice pCAMBIA1302 como control positivo y ADN genómico de C. vulgaris de tipo salvaje como control negativo.
  2. Para confirmar que no hay pCAMBIA1302 presente en la muestra debido a la contaminación residual por A. tumefaciens, utilice la PCR de colonias. Añadir una pequeña cantidad de células transformantes a 10 μL de agua estéril y hervir a 98 °C durante 15 min. Utilícelo como plantilla para la PCR.
    1. Diseñe cebadores para una región fuera del ADN-T en pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' y B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      NOTA: Para el presente estudio se utilizaron las siguientes condiciones: 94 °C durante 3 min; 30 ciclos (94 °C durante 30 s, 48 °C durante 30 s, 68 °C durante 5 min); 68 °C durante 7 min. Utilizar una colonia hervida de A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) como control positivo y una colonia hervida de C. vulgaris de tipo silvestre como control negativo.
  3. Para confirmar que no hay contaminación por A. tumerfaciens presente en la muestra, utilice la PCR de colonias. Añadir una pequeña cantidad de células transformantes a 10 μL de agua estéril y hervir a 98 °C durante 15 min. Utilícelo como plantilla para la PCR.
    1. Diseño de cebadores para el gen virE2 contenido en el plásmido de virulencia AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' y virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      NOTA: Para el presente estudio se utilizaron las siguientes condiciones: 94 °C durante 3 min; 30 ciclos (94 °C durante 30 s, 53 °C durante 30 s, 68 °C durante 3 min); 68 °C durante 7 min. Utilizar una colonia hervida de A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) como control positivo y una colonia hervida de C. vulgaris de tipo silvestre como control negativo.
  4. Realice muestras de PCR en un gel de agarosa de ADN junto con una escalera (escalera de ADN de 1 Kbp, ver Tabla de Materiales) para confirmar el tamaño de los fragmentos resultantes16.

5. Medición de la fluorescencia de los transformantes

  1. Inocular cada transformante de un cultivo de mantenimiento en fase logarítmica o de agar TAP en 50 mL de TAP suplementado con 200 mg/L-1 de cefotaxima y 25 mg/L-1 de higromicina B de modo que la DO inicialsea de 600 = 0,1. Inocular un cultivo con C. vulgaris de tipo salvaje y solo 200 mg/L-1 de cefotaxima como control negativo. Incubar a 25 °C a 150 rpm con 150 μmol/m2s de luz fotosintéticamente activa (ver Tabla de Materiales).
  2. Cada 24 h, tome una muestra de 300 μL y mida la absorbancia y fluorescencia (excitación 488 nm, emisión 526 nm) en un lector de placas de 96 pocillos o espectrómetro y fluorómetro UV/Vis (ver Tabla de Materiales). Utilice una placa negra con fondo transparente para mediciones simultáneas.

6. Extracción de proteína bruta, purificación de proteínas y electroforesis SDS-PAGE

  1. Inocular transformante (#50) de un cultivo de mantenimiento en fase logarítmica en 300 mL de TAP suplementado con 200 mg/L-1 de cefotaxima y 25 mg/L-1 de higromicina B para alcanzar el DO680 = 0,1. Inocular un cultivo con C. vulgaris de tipo salvaje y solo 200 mg/L-1 de cefotaxima como control negativo. Incubar a 25 °C a 150 rpm con 150 μmol/m2s de luz fotosintéticamente activa.
  2. Extraiga la muestra de proteína bruta de las cepas transformante (#50) y salvaje utilizando un tampón de lisis de 5 ml (véase la Tabla 1), seguido de sonicación durante 4 min.
  3. Purifique la muestra de proteína cruda con una resina de Ni-NTA a través de columnas de polipropileno de 5 mL (ver Tabla de Materiales).
  4. Liofilizar las muestras de proteínas purificadas de 15 mL y resuspenderlas en tampón de lisis de 1 mL para el análisis SDS-PAGE17.

Resultados

Para demostrar el éxito de la transformación utilizando el método anterior, C. vulgaris se cocultivó con AGL-1 que contenía el plásmido pCAMBIA1302 o sin el plásmido (tipo salvaje y se colocó en agar TAP suplementado con higromicina B y cefotaxima (Figura 1A). La placa más a la izquierda muestra las colonias transformadas capaces de crecer en las placas de higromicina B/cefotaxima, y la placa del medio muestra que AGL-1 de tipo salvaje no puede crecer en las placas de higro...

Discusión

La eficiencia de la transformación está asociada a varios parámetros diferentes. La elección de las cepas de A. tumefaciens utilizadas para AMT es crucial. AGL-1 es una de las cepas más invasivas descubiertas y, por esta razón, se ha utilizado de forma rutinaria en la AMT de las plantas. La suplementación de los medios de inducción con glucosa (15-20 mM) también es importante para la eficiencia de la AMT. Teniendo en cuenta que C. vulgaris puede crecer tanto en condiciones fototróficas como he...

Divulgaciones

No se declararon conflictos de interés.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Prof. Paul Hooykaas por proporcionar amablemente el vector pCAMBIA1302 y Agrobacterium tumefaciens AGL1 del Instituto de Biología de Leiden, Universidad de Leiden, Países Bajos. Los autores también quieren agradecer a Eva Colic por su ayuda en el cultivo de los transformadores fluorescentes. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y el programa Mitacs Accelerate.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 Kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015
AcetosyringoneFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesStrain: AGL-1; Gift from Prof. Paul HooykaasGenotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotinEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2·2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximeAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of AlgaeStrain: UTEX 395Wildtype strain
CoCl2·6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4·5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3·6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652662Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification KitThermo ScientificK0791
Glacial acetic acidVWRCABDH3093-2.2P
GlycerolBioBasicGB0232
HEPES BufferSigma AldrichH-3375
Hygromycin BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4·7H2OVWR97062-134
MnCl2·4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA·2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4·2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3 VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Leiden UniversityGift from Prof. Paul HooykaaspBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mLBio-Rad1610363
RifampicinMillipore SigmaR3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch SunBlaster210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer BioTEKS4MLFPTA
TetracyclineThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad1610185
ThiamineTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptoneBioBasicTG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)Enzo Life Sciences89151-436
Yeast ExtractBioBasicG0961
ZnSO4·7H2OJT Baker4382-01

Referencias

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