Detección de canales iónicos en células cancerosas

Resumen

La focalización farmacológica de los canales iónicos es un enfoque prometedor para el tratamiento de tumores sólidos. Se proporcionan protocolos detallados para caracterizar la función de los canales iónicos en las células cancerosas y analizar los efectos de los moduladores de los canales iónicos en la viabilidad del cáncer.

Resumen

Los canales iónicos son fundamentales para el desarrollo celular y el mantenimiento de la homeostasis celular. La perturbación de la función de los canales iónicos contribuye al desarrollo de una amplia gama de trastornos o canalopatías. Las células cancerosas utilizan canales iónicos para impulsar su propio desarrollo, así como para mejorar como tumor y asimilarse en un microambiente que incluye varias células no cancerosas. Además, los aumentos en los niveles de factores de crecimiento y hormonas dentro del microambiente tumoral pueden resultar en una mayor expresión de canales iónicos, lo que contribuye a la proliferación y supervivencia de las células cancerosas. Por lo tanto, la focalización farmacológica de los canales iónicos es potencialmente un enfoque prometedor para el tratamiento de neoplasias malignas sólidas, incluidos los cánceres cerebrales primarios y metastásicos. En este trabajo se describen protocolos para caracterizar la función de los canales iónicos en células cancerosas y enfoques para analizar los moduladores de los canales iónicos para determinar su impacto en la viabilidad del cáncer. Estos incluyen la tinción de una célula para un canal iónico, la prueba del estado polarizado de las mitocondrias, el establecimiento de la función del canal iónico mediante electrofisiología y la realización de ensayos de viabilidad para evaluar la potencia del fármaco.

Introducción

Las proteínas transportadoras de membrana son fundamentales para la comunicación entre las células, así como para mantener la homeostasis celular. Entre las proteínas transportadoras de membrana, los canales iónicos sirven para impulsar el crecimiento y desarrollo de las células y para mantener el estado de las células en entornos desafiantes y cambiantes. También se ha descrito que los canales iónicos impulsan y apoyan el desarrollo de tumores sólidos, tanto sistémicamente como en el sistema nervioso central (SNC)^1,2. Por ejemplo, los canales KCa3.1 son responsables de regular el potencial de membrana y contr....

Protocolo

1. Inmunomarcaje de canales iónicos en células cultivadas

1. Preparación de las células y puesta en marcha experimental
   1. Mantener las células como un cultivo en crecimiento activo en matraces de^{75 cm2} de cultivo. Pase las células una vez hasta que se vuelvan 50%-90% confluentes, dependiendo del tiempo de duplicación de la línea celular que se esté utilizando.
      NOTA: Para el presente estudio, se utilizaron células D283, una línea celular de meduloblastoma del Grupo 3.
   2. Recoja las células del matraz de cultivo en un tubo de centrífuga (15 ml o 50 ml) y agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25 % para separar las células adherentes. Incuba....

Discusión

Los cambios en la función de los canales iónicos alteran las cascadas de señalización intracelular, lo que puede afectar el funcionamiento general de una célula. Durante la última década, se ha vuelto cada vez más claro que los canales iónicos son importantes para el crecimiento y la metástasis de las células cancerosas. Es importante destacar que muchos canales iónicos son objetivos primarios para terapias aprobadas dirigidas a una amplia gama de trastornos²⁴. Los investigadores han i.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS - Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841