Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

Resumen

Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

Resumen

Las mitocondrias están presentes en prácticamente todas las células eucariotas y realizan funciones esenciales que van mucho más allá de la producción de energía, por ejemplo, la síntesis de grupos de hierro-azufre, lípidos o proteínas, la amortiguación de Ca²⁺ y la inducción de la apoptosis. Del mismo modo, la disfunción mitocondrial da lugar a enfermedades humanas graves como el cáncer, la diabetes y la neurodegeneración. Para realizar estas funciones, las mitocondrias tienen que comunicarse con el resto de la célula a través de su envoltura, que consta de dos membranas. Por lo tanto, estas dos membranas tienen que interactuar constantemente. Los sitios de contacto proteico entre las membranas interna y externa mitocondrial son esenciales a este respecto. Hasta el momento, se han identificado varios sitios de contacto. En el método descrito aquí, las mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae se utilizan para aislar los sitios de contacto y, por lo tanto, identificar candidatos que califican para proteínas del sitio de contacto. Utilizamos este método para identificar el complejo del sitio de contacto mitocondrial y el sistema organizador de crestas (MICOS), uno de los principales complejos formadores de sitios de contacto en la membrana interna mitocondrial, que se conserva de la levadura a los humanos. Recientemente, mejoramos aún más este método para identificar un nuevo sitio de contacto que consiste en Cqd1 y el complejo Por1-Om14.

Introducción

Las mitocondrias realizan una variedad de funciones diferentes en los eucariotas, siendo la más conocida la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Otras funciones incluyen la producción de grupos de hierro-azufre, la síntesis de lípidos y, en eucariotas superiores, la señalización de Ca²⁺ y la inducción de la apoptosis 1,2,3,4. Estas funciones están inseparablemente ligadas a su compleja ultraestructura.

La ultraestructura mitocondrial fue descrita por primera vez por microscopía elec....

Protocolo

1. Tampones y soluciones madre

1. Prepare una solución de ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS) 1 M en agua desionizada, pH 7,4. Conservar a 4 °C.
2. Preparar 500 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en agua desionizada, pH 8,0. Almacenar a temperatura ambiente.
3. Preparar sorbitol 2,4 M en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.
4. Preparar 2,5 M de sacarosa en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.
5. Prepare 200 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en isopropanol. Conservar a -20 °C.
   PRECA....

Discusión

El subfraccionamiento mitocondrial es un experimento complicado con varios pasos muy complejos. Por lo tanto, nuestro objetivo era mejorar aún más y, hasta cierto punto, simplificar nuestro método establecido³². En este caso, los desafíos eran la necesidad de equipos complicados y altamente especializados, que a menudo son construcciones individuales, y el enorme consumo de tiempo y energía. Con este fin, intentamos eliminar las bombas y las construcciones individuales utilizadas para la fund.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855