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Resumen

El presente estudio describe metodologías basadas en la descelularización para visualizar y cuantificar la deposición de tejido adiposo intramuscular (IMAT) a través del volumen muscular intacto, así como cuantificar las métricas de los adipocitos individuales que componen IMAT.

Resumen

La infiltración grasa es la acumulación de adipocitos entre las miofibras del músculo esquelético y es una característica destacada de muchas miopatías, trastornos metabólicos y distrofias. Clínicamente en poblaciones humanas, la infiltración grasa se evalúa mediante métodos no invasivos, como la tomografía computarizada (TC), la resonancia magnética nuclear (RM) y la ecografía (US). Aunque algunos estudios han utilizado la TC o la RM para cuantificar la infiltración grasa en el músculo del ratón, los costos y la resolución espacial insuficiente siguen siendo un desafío. Otros métodos para animales pequeños utilizan la histología para visualizar adipocitos individuales; Sin embargo, esta metodología adolece de sesgo de muestreo en patología heterogénea. Este protocolo describe la metodología para ver cualitativamente y medir cuantitativamente la infiltración grasa de forma exhaustiva a través del músculo intacto del ratón y a nivel de los adipocitos individuales mediante la descelularización. El protocolo no se limita a músculos específicos o especies específicas y puede extenderse a la biopsia humana. Además, las evaluaciones cualitativas y cuantitativas brutas se pueden realizar con equipos de laboratorio estándar a bajo costo, lo que hace que este procedimiento sea más accesible en todos los laboratorios de investigación.

Introducción

La acumulación de adipocitos entre las miofibras dentro del músculo esquelético es una característica prominente de afecciones dispares, desde la diabetes tipo 2 hasta la sarcopenia y las lesiones musculoesqueléticas 1,2,3,4,5,6,7. La evaluación integral de este tejido adiposo intramuscular (IMAT) es fundamental para comprender la patogénesis de estas afecciones, ya que el depósito de IMAT está fuertemente correlacionado con la resistencia a la insulina 3,8,9,10 y una función muscular esquelética deficiente 11,12,13,14,15 . Aunque estas asociaciones se han observado durante décadas, los mecanismos asociados y el origen de la IMAT siguen siendo un área de intensa investigación. Esto se debe, en parte, a que la mayoría de los estudios que evalúan la infiltración grasa del músculo esquelético se han realizado en humanos, donde las investigaciones mecanicistas son limitadas16,17. Sin embargo, más recientemente, se han utilizado modelos de animales pequeños, incluidos ratones, para ayudar a identificar la regulación celular del desarrollo y la señalización de IMAT18,19,20. Este trabajo tiene como objetivo proporcionar una nueva herramienta para su uso con modelos de animales pequeños para visualizar y cuantificar cualitativamente la infiltración grasa del músculo esquelético.

Clínicamente en poblaciones humanas, la infiltración grasa se evalúa mediante métodos no invasivos, como la tomografía computarizada (TC)6,21, la resonancia magnética (RM)16,17,22,23 y la ecografía (US)17,24. Estas técnicas de imagen suelen identificar una región de interés definida (ROI) en un músculo y adquirir cortes de imagen dentro de esa región, aunque también se han empleado enfoques integrales25,26,27. Estos cortes de imagen se someten a una gradación cualitativa6 y se cuantifican a través del umbral de píxeles28. Enfoques similares se han utilizado anteriormente en animales29,30; sin embargo, son costosos y requieren acceso a sistemas de imágenes de animales pequeños. La resolución espacial a través del uso de TC y RM también presenta un problema importante, ya que no pueden delinear los adipocitos IMAT de las fibras musculares esqueléticas dentro de un vóxel y, en cambio, se basan en la separación subjetiva de las regiones musculares principales y las regiones IMAT31,32. Como tal, la incapacidad de identificar con precisión el tejido graso o muscular también presenta una cuantificación inexacta de cantidades representativas de estos tejidos.

Debido a estas limitaciones, las técnicas actuales para evaluar la infiltración grasa del músculo esquelético en modelos de animales pequeños se basan más comúnmente en la histología como una alternativa barata y accesible33,34. Los procedimientos de tinción estándar, que incluyen hematoxilina y eosina (H&E), aceite rojo O (ORO) e inmunotinción para marcadores de adipocitos como la perilipina, permiten una detección y visualización sencillas de los adipocitos que comprenden la infiltración de grasa dentro del músculo. Sin embargo, los enfoques histológicos rara vez son exhaustivos y, por lo general, la evaluación cualitativa o cuantitativa del IMAT se limita a una sola sección34. La extracción de lípidos también se ha utilizado para cuantificar los lípidos musculares totales35; sin embargo, esta técnica no distingue entre los depósitos de lípidos intramiocelulares (IMCL) y de tejido adiposo intramuscular (IMAT)36. En resumen, las metodologías actuales para visualizar y cuantificar la grasa en el músculo siguen estando limitadas ya sea por los costes financieros o por la detección específica de IMAT.

Aquí, describimos un método detallado para evaluar la infiltración grasa del músculo esquelético tanto mediante visualización cualitativa como cuantificación multiescala. Esta metodología emplea una técnica de descelularización simple que elimina las estructuras miocelulares, incluido el IMCL, pero mantiene intactas las gotas lipídicas más grandes derivadas de adipocitos IMAT. Se ha publicado la validación de la especificidad de esta técnica37, incluyendo el uso de la extracción de lípidos para mostrar la depleción del IMCL con la descelularización, la μCT para mostrar la retención del patrón IMAT con la descelularización y la histología para mostrar la distribución de tamaño similar de las gotas lipídicas de IMAT en comparación con las identificadas con la descelularización. Una vez descelularizados, los músculos se pueden teñir con colorantes solubles en lípidos para la visualización cualitativa del patrón y el alcance de la infiltración de grasa y/o la obtención de imágenes cuantitativas de gotas de lípidos IMAT individuales. Posteriormente, los colorantes se pueden extraer con isopropanol y la densidad óptica (DO) de la solución resultante se puede utilizar para estimar el volumen de lípidos IMAT. La validación rigurosa de esta técnica ha sido publicada en otro lugar37. En este artículo se proporciona un protocolo detallado para utilizar esta metodología con músculos de ratón y se proporcionan sugerencias para la solución de problemas para respaldar la adopción de este método en otras aplicaciones, como músculos de otras especies u otros tejidos.

Protocolo

El cuidado y sacrificio de los ratones se realizó de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todo el trabajo fue aprobado por el Comité de Estudios Animales de la Facultad de Medicina de St. Louis de la Universidad de Washington. Se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 2-3 meses de edad (ver Tabla de Materiales) para generar las imágenes de ejemplo incluidas en este protocolo. Todos los pasos que se describen a continuación se realizan a temperatura ambiente.

1. Descelularización muscular

  1. Prepare una solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% p/v; consulte la Tabla de materiales) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Revuelva la solución hasta que esté completamente mezclada.
    NOTA: La SDS al 1% se puede preparar a granel y almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes.
  2. Diseccionar el/los músculo(s) de interés como se ha descrito anteriormente38,39.
    1. Exponga los músculos de interés mojando el cabello y la piel con una solución de etanol al 70%, luego haga una incisión transcutánea de aproximadamente 2 cm seguida de la extracción de la piel que cubre con pinzas y tijeras de resorte.
      NOTA: Los músculos de interés aquí incluyen el tibial anterior (TA), el extensor largo de los dedos (EDL) y el diafragma. Algunos músculos pueden estar profundamente en otra musculatura, lo que requiere la disección de otros músculos (p. ej., la disección de la EDL requiere la extirpación de la AT).
    2. Diseccione los músculos de interés con tijeras o cuchillas afiladas (consulte la Tabla de materiales) para asegurarse de que se obtiene toda la extensión del músculo y que los bordes son lisos.
      NOTA: Lo ideal es hacerlo bajo un microscopio de disección para mejorar la visualización.
    3. Inspeccione los músculos para asegurarse de que no se incluyan astillas de hueso o bordes irregulares, luego recórtelos con tijeras afiladas según sea necesario.
    4. Pesa el músculo con una balanza analítica y registra el peso.
  3. Coloque el músculo diseccionado en al menos 0.1 ml de SDS al 1% por miligramo de peso; Las placas de 6, 12 o 24 pocillos funcionan bien para los músculos del diafragma, TA y EDL del ratón, respectivamente. Los volúmenes típicos son de 6 ml, 3 ml y 1,5 ml para placas de 6, 12 y 24 pocillos, respectivamente.
    NOTA: La solución SDS a veces hará que los músculos se deformen, así que asegúrese de que el músculo esté plano/extendido en la inmersión inicial.
  4. Coloque la placa del pocillo (u otros recipientes) en un agitador oscilante ajustado a 50-80 Hz.
  5. Inspeccione visualmente la solución SDS periódicamente. Cuando la solución se vuelva turbia, retire la solución con una pipeta (teniendo cuidado de no aspirar el músculo) y reemplácela con un volumen igual de SDS fresca al 1%. Cuando la solución permanece clara durante 24 horas, la descelularización se ha completado.
    NOTA: La frecuencia requerida para los cambios de solución varía según el tamaño del músculo y el volumen inicial de la solución. Los músculos más grandes, como el TA, necesitan una nueva SDS en unas pocas horas, y los músculos más pequeños, como el EDL, pueden pasar la noche en la solución original.
  6. Retire la solución final de SDS de los músculos descelularizados con una pipeta (teniendo cuidado de no aspirar el músculo) y reemplácela con un volumen igual de PBS.
  7. Inspeccione visualmente los músculos descelularizados bajo un microscopio de disección y use pinzas y tijeras para eliminar cualquier vello o residuo que esté pegado al músculo.
    NOTA: Además, observe la claridad del músculo descelularizado en este paso. Si el músculo descelularizado no es completamente transparente y la solución SDS no aumenta su turbidez durante 24 h, entonces la descelularización no fue eficiente. Esto crea un artefacto en las evaluaciones cualitativas y cuantitativas, por lo que la descelularización siempre debe optimizarse en muestras de práctica antes de proceder con músculos experimentales.
  8. Retire con cuidado el PBS, reemplácelo con un volumen igual de solución de formaldehído al 3,7% o paraformaldehído al 4% y regrese la placa al agitador oscilante durante 24 h.
    NOTA: Asegúrese de que la solución de formaldehído cubra completamente el músculo descelularizado, de lo contrario, la tinción será desigual.

2. Visualización de IMAT con aceite rojo O

  1. Prepare una solución de ORO.
    1. Disolver 0,5 g de polvo de ORO (ver Tabla de Materiales) en 100 mL de isopropanol para generar una solución madre.
      NOTA: Agregue calor suave a la solución para disolverla por completo. Este stock se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes.
    2. Combine la solución madre de ORO y el agua desionizada en una proporción de 60:40 para obtener la solución de trabajo necesaria para todos los músculos utilizando un volumen de al menos 0,1 ml/mg de peso muscular. Los volúmenes típicos son de 6 ml, 3 ml y 1,5 ml para placas de 6, 12 y 24 pocillos, respectivamente.
      NOTA: Inspeccione la solución madre antes de mezclarla. Si la solución madre contiene partículas sustanciales, prepare caldo nuevo.
    3. Cubra la solución de trabajo durante 10 minutos para permitir que las partículas se asienten.
    4. Filtre la solución de trabajo a través de una malla de 40 μm, seguida de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
      NOTA: El filtro de jeringa de 0,22 μm se obstruye rápidamente y debe cambiarse si la solución de trabajo no se empuja fácilmente.
  2. Retire la solución de formaldehído o paraformaldehído y lave los músculos descelularizados con tres cambios de solución de igual volumen de PBS.
  3. Reemplace el PBS con un volumen igual de solución de isopropanol al 60% e incube en un agitador oscilante durante 5 min.
  4. Reemplace la solución de isopropanol al 60% con una solución de trabajo ORO e incube en el agitador oscilante durante 10 minutos.
    NOTA: Asegúrese de que la solución de trabajo ORO cubra completamente el músculo descelularizado, de lo contrario, la tinción será desigual.
  5. Reemplace la solución de trabajo ORO con un volumen igual de SDS al 1 %. Inspeccione visualmente la solución SDS periódicamente. Cuando la solución se vuelva notablemente rosada, retire la solución con una pipeta (teniendo cuidado de no aspirar el músculo) y reemplácela con una SDS fresca al 1%.
  6. Cuando la solución permanezca clara durante 24 horas, reemplace la SDS al 1% con PBS e inspeccione el músculo teñido bajo un microscopio de disección/estereoscópico con un aumento de 4x. Retira cualquier residuo obvio o partícula adherida al exterior del músculo. Si esto es extenso, el músculo descelularizado se puede enrollar suavemente sobre un pañuelo de limpieza para eliminar los desechos/partículas.
  7. Si la tinción es satisfactoria (esferas de color rojo brillante flotando en una matriz transparente), adquiera imágenes de la tinción como desee utilizando una cámara conectada al microscopio estereoscópico (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Si el microscopio de disección no tiene una cámara conectada, se puede usar una cámara de teléfono para tomar imágenes a través del ocular.

3. Visualización de gotas lipídicas IMAT con BODIPY

NOTA: Las imágenes confocales son más efectivas con músculos delgados como el EDL o el diafragma (~ 2 mm de grosor). Alternativamente, se podrían usar tiras de músculos de grosor comparable como el TA.

  1. Preparar una solución 1:200 de BODIPY 493/503 fluorescente (ver Tabla de Materiales) en PBS para obtener un volumen de solución de trabajo de al menos 0,1 mL/mg de peso muscular. Los volúmenes típicos son de 6 ml, 3 ml y 1,5 ml para placas de 6, 12 y 24 pocillos, respectivamente.
  2. Retire el formaldehído, el paraformaldehído o la SDS al 1% y lave los músculos descelularizados con tres cambios de solución de un volumen igual de PBS.
  3. Sustituya el PBS por la solución de trabajo BODIPY e incube en el agitador oscilante durante 20 min.
  4. Lavar los músculos descelularizados con tres cambios de solución de igual volumen de PBS.
  5. Coloque el músculo en un vaso de fondo transparente que sea compatible con un microscopio confocal disponible. Lo ideal es que el plato tenga un fondo empotrado para colocar un cubreobjetos sobre el músculo sin deformarlo (ver Tabla de Materiales).
  6. Obtenga pilas de imágenes con un microscopio confocal estándar (consulte la Tabla de materiales) utilizando el láser 488. Los tamaños de pila típicos para una EDL son de 0,5 a 1 mm con un grosor de corte de 10 μm, lo que produce entre 50 y 100 imágenes por pila.
    NOTA: Para cuantificar el volumen lipídico total, el número total de gotas lipídicas IMAT y el índice de agrupamiento vecino más cercano, tome imágenes a través de todo el volumen muscular, teniendo cuidado de dejar cierta superposición para el registro de imágenes. Para cuantificar el volumen medio de las gotas de lípidos, una pila puede ser suficiente.
  7. Si lo desea, tiña los músculos con ORO, como se indica en la sección 2, para obtener una imagen complementaria de todo el músculo de la distribución de IMAT.
    NOTA: Debido a que BODIPY es fluorescente, no será visible bajo el microscopio óptico cuando se adquieran imágenes de ORO.

4. Estimación del volumen lipídico total por extracción lipídica

  1. Después de la adquisición de la imagen, transfiera los músculos a 200 μL de isopropanol en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos, o adapte el pocillo/volumen si el músculo es demasiado grande para caber.
  2. Agite la solución golpeando la placa, pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo, y/o aplastando mecánicamente el músculo con la punta de una pipeta hasta que no se puedan ver esferas rojas/fluorescentes en el músculo descelularizado bajo un microscopio.
    NOTA: Trate todos los músculos con la misma combinación de golpecito, pipeteo y aplastamiento para obtener la mejor confiabilidad. Además, tenga cuidado de limitar el tiempo dedicado a la roscación, el pipeteo y la trituración, ya que el isopropanol se evaporará rápidamente.
  3. Mezcle la solución en cada pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo, luego transfiera 75 μL a dos pocillos limpios de la placa.
  4. Cubra la placa y lea la absorbancia de los pocillos duplicados de 75 μL utilizando un espectrofotómetro o un lector de placas. Si la construcción se tiñó con ORO, lea la solución a 500 nm; si estaba teñido con BODIPY 493/503, lea la placa a 493 nm.
    NOTA: Si la construcción se tiñó con BODIPY y ORO, se recomienda leer la placa a 500 nm, ya que las lecturas de 500 nm dan resultados similares entre las construcciones teñidas solo con ORO y ORO más BODIPY.
  5. Divida la lectura de absorbancia por el peso registrado del músculo si lo desea para corregir las diferencias de tamaño entre las muestras.

5. Cuantificación de las métricas de gotas de lípidos IMAT a partir de imágenes confocales

NOTA: Esta sección requiere acceso a la versión 1.47 de ImageJ (consulte la Tabla de materiales) o posterior y habilidades básicas de ImageJ40.

  1. Abra pilas confocales en ImageJ.
    NOTA: Diferentes microscopios confocales pueden guardar imágenes confocales en diferentes formatos. ImageJ puede requerir un complemento o variante adicional, como Fiji, para abrir las pilas41. Los algoritmos utilizados forman parte del paquete de software ImageJ.
  2. Ejecute un algoritmo de umbral en ImageJ para identificar los píxeles positivos BODIPY. Esto convierte la imagen actual en una imagen binaria.
    1. Abra la interfaz de usuario del umbral seleccionando Imagen > Ajustar > umbral. En la interfaz de usuario, seleccione Intermodos como tipo de umbral y asegúrese de que el fondo oscuro esté seleccionado. No es necesario seleccionar ninguna otra opción. A continuación, haga clic en Aplicar.
    2. Se abre un cuadro de diálogo para convertir la pila en binaria. Asegúrese de que tiene seleccionadas las siguientes opciones: Método: Intermodos; Fondo: Oscuro. Calcule el umbral para cada imagen y fondo negro (de máscaras binarias). Esto genera una pila binaria, donde el blanco indica píxeles positivos BODIPY y el negro indica píxeles negativos BODIPY.
      NOTA: Es posible que el algoritmo de umbral Intermodes no sea la mejor opción para todos los usuarios. La inspección subjetiva de las opciones de umbral incorporadas de ImageJ ayuda a seleccionar el algoritmo óptimo para separar los píxeles positivos y negativos de BODIPY.
  3. Ejecute el algoritmo Watershed en ImageJ para separar las gotas de lípidos que tocan. Seleccione Procesar > Binario > Cuenca hidrográfica. Se abre un cuadro de diálogo en el que se pregunta si se deben procesar todas las imágenes de la pila. Seleccione Sí. Esto agrega líneas negras delgadas que dividen áreas más grandes de blanco sólido.
  4. Identifique el ROI con el algoritmo Analizar partículas en ImageJ.
    1. Seleccione Analizar > Analizar partículas. Se abre un cuadro de diálogo para establecer la configuración de selección.
      NOTA: La selección del rango de tamaño es fundamental para lograr la mejor estimación del ROI de las gotas de lípidos. El límite inferior elimina las regiones que probablemente sean demasiado pequeñas para ser gotas lipídicas derivadas de IMAT (artefacto de fondo), y el límite superior elimina las regiones que probablemente sean demasiado grandes para ser gotas lipídicas derivadas de IMAT únicas (que tocan gotas lipídicas que no fueron separadas por el algoritmo Watershed).
    2. Para establecer estos valores, abra la imagen original y delinee la gota de lípidos más pequeña y más grande a la vista con la herramienta Óvalo. A continuación, añade estas formas al gestor de ROI escribiendo "t". Seleccione Analizar y, a continuación, Establecer medidas. Se abre un cuadro de diálogo para seleccionar los ajustes.
      1. Marque Solo área y haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione Medir en el Administrador de ROI. Utilice las dos medidas de área de esta ventana Resultados como rango de tamaño en Analizar partículas.
    3. Asegúrese de que la opción Agregar al administrador esté marcada. No se necesitan otras opciones.
  5. Superponga los ROI en la pila confocal marcando Mostrar todo en el Administrador de ROI. Utilice la barra deslizante para inspeccionar cada sector de la pila individualmente y añada los pasajes que faltan a mano con la herramienta Óvalo (ubicada en la barra de herramientas de ImageJ).
  6. Genere las mediciones de ROI. Seleccione Analizar > Establecer medidas y seleccione Área, Centroide, Ajustar elipse y Posición de pila. Haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione Medir en el Administrador de ROI. Los datos de la tabla de resultados se pueden seleccionar y copiar en Matlab o Excel para su posterior análisis.
  7. Refinar el ROI de cada pila a un único ROI utilizando el código37 de Refine.m Matlab o un algoritmo similar.
    NOTA: Este paso es necesario ya que los pasos 5.2-5.4 identifican la misma gota de lípidos en cortes adyacentes como ROI distintos. Sin embargo, los ROI se pueden identificar alternativamente solo a mano, o los ROI duplicados se pueden eliminar a mano en ImageJ para evitar la necesidad de Matlab.
  8. Obtenga las estadísticas de resumen en el ROI utilizando Matlab o Excel.
    1. Calcule el número total de gotas de lípidos como el número total de ROI.
    2. Estime el volumen de las gotas de lípidos como el volumen de la elipse ajustado a cada ROI 2D, asumiendo que la profundidad de la forma es el promedio de los ejes mayor y menor de la elipse.
    3. Estime el volumen total de lípidos, que es la suma de los volúmenes individuales estimados de gotas de lípidos.

Resultados Representativos

Visualización cualitativa de la infiltración grasa del músculo esquelético
Los músculos correctamente descelularizados son blancos y semitransparentes (sección 1; Figura 1). Cuando los músculos descelularizados se tiñen con ORO para visualizar IMAT (sección 2), las gotas de lípidos de IMAT son evidentes dentro de las estructuras musculares claras como esferas rojas (Figura 1). Los músculos sanos de las extremidades posteriores de ratón tienen poco IMAT natural, evidenciado por poco o ningún lípido rojo ORO positivo (Figura 1A). En comparación, los músculos de las extremidades posteriores inyectados con cardiotoxina (CTX; Figura 1B) o glicerol (GLY; Figura 1C) 14 días antes de la descelularización tienen una mayor acumulación de IMAT, con una mayor concentración de IMAT después de CTX en comparación con GLY como se señaló anteriormente37.

La descelularización incompleta puede identificarse inmediatamente después del tratamiento inicial con SDS o después del lavado de la tinción de ORO como fibras semiopacas de color rosa claro (Figura 2B comparada con Figura 2A). La eliminación incompleta de ORO se puede identificar después del lavado de ORO como un fondo uniforme rosado o rojo, en lugar de líneas de fibra distintivas (Figura 2C). La figura 2A, B también contiene tejido adiposo epimuscular (asteriscos), un grupo de gotas de lípidos fuera del músculo descelularizado. La figura 2C también muestra el plegamiento muscular que puede ocurrir si los músculos no se extienden durante la descelularización. La descelularización incompleta, el aclaramiento incompleto de ORO y el tejido adiposo epimuscular residual aumentan artificialmente la (DO) de los lípidos extraídos, pero no necesariamente impiden la evaluación cualitativa de la infiltración grasa si se reconocen como un artefacto.

Imágenes cuantitativas de la infiltración grasa del músculo esquelético
Las gotas lipídicas marcadas con fluorescencia BODIPY se pueden obtener mediante microscopía confocal para una evaluación más detallada de las métricas y la distribución de las gotas lipídicas individuales (Figura 3). Este proceso es semiautomatizado, como se describió anteriormente, incluyendo el código37 de Matlab. Una buena tinción BODIPY da como resultado formas elípticas brillantes delineadas de formas vecinas cuando se visualizan en plano (Figura 3A). El umbral y la segmentación de formas proporcionan un buen primer paso para generar ROI para cada gota de lípidos (Figura 3B), pero se necesitan ediciones manuales para corregir errores. El error más generalizado son las gotas de lípidos que se encuentran en lo profundo del tejido y, por lo tanto, no son brillantes en ninguna de las rodajas (Figura 3B; flechas dobles rosadas). Esto se puede remediar agregando ROI a mano usando la herramienta Óvalo en ImageJ (Figura 3C). La segunda es la identificación de un grupo de gotas de lípidos como un único ROI (Figura 3B; asterisco rojo). Esto se puede corregir eliminando y reemplazando el ROI original con varios ROI nuevos (Figura 3D). Por último, una sola gota de lípidos se identifica como un ROI único en varios segmentos, por lo que los ROI duplicados deben consolidarse en un único ROI (Figura 3E; flecha azul). Esto se hace más fácilmente utilizando una herramienta de procesamiento de datos como Matlab, pero también se puede hacer a mano identificando el ROI más grande y eliminando el resto. Los valores promedio para cada métrica en el ratón C57BL6/J y 129Sv se pueden encontrar en Biltz et al.37.

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Figura 1: Ejemplo de tinción de aceite rojo O (ORO) de músculos descelularizados. Músculos teñidos de ORO 14 días después de la inyección con solución salina (SAL), cardiotoxina (CTX) o glicerol (GLY). Los músculos extensor largo de los dedos (EDL) y tibial anterior (TA) de ratón tienen poco IMAT (esferas rojas) con el tratamiento con SAL (A), pero acumulan IMAT en respuesta al tratamiento con CTX (B) y GLY (C). Hay una descelularización completa y un lavado de ORO, evidenciado por distintas gotas de lípidos ORO positivo en un fondo muscular blanco transparente. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ejemplos de malos resultados de tinción de ORO. La descelularización incompleta o la eliminación incompleta de ORO dan lugar a un fondo rosa/rojo semiopaco. En comparación con el fondo blanco transparente del músculo del diafragma de ratón totalmente descelularizado (A), la descelularización incompleta se caracteriza por rastros de fibra de color rosa claro/rojo (B), y el aclaramiento incompleto de ORO se caracteriza por un fondo difuso de color rosa/rojo (C). Barras de escala: paneles superiores = 1 mm; paneles inferiores = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ejemplos de identificación de gotas lipídicas individuales con tinción fluorescente de BODIPY y microscopía confocal Las gotas de lípidos individuales teñidas con BODIPY pueden identificarse y cuantificarse en músculos descelularizados mediante microscopía confocal. Los cortes individuales a través de una pila confocal muestran las gotas de lípidos en el plano como elipses de color verde brillante y las gotas de lípidos fuera del plano como formas más tenues (A; flechas azules). El umbral combinado con la segmentación de objetos de cuencas hidrográficas y la identificación del ROI puede mapear ROI teñidos de BODIPY (B). El umbral puede pasar por alto algunas gotas de lípidos más débiles (B; doble flecha rosa), lo que requiere identificación a mano (C). La segmentación de la cuenca hidrográfica puede agrupar varias gotas de lípidos (B; asterisco rojo), lo que requiere la eliminación del ROI y la reestimación manual (D). La misma gota de lípidos se identifica en varios cortes que requieren el registro de la imagen (E) para eliminar los ROI duplicados. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este manuscrito describe métodos para visualizar y cuantificar cualitativamente la infiltración grasa del músculo esquelético en modelos de animales pequeños que se pueden aplicar para comprender mejor la patogénesis del desarrollo y la expansión patológica del tejido adiposo intramuscular (IMAT). El uso de la descelularización del músculo entero y la tinción soluble en lípidos permite una metodología rentable, reproducible y sencilla para evaluar de forma exhaustiva la presencia de IMAT en los músculos completos.

La base de este protocolo es que la descelularización del músculo con SDS elimina los componentes celulares de las miofibras, incluidas las pequeñas gotas de lípidos de IMCL, pero preserva las grandes gotas de lípidos en los adipocitos intramiocelulares. La SDS se ha utilizado ampliamente42 en ingeniería de tejidos para descelularizar matrices. Los tejidos, como el músculo adiposo y el músculo esquelético, suelen requerir una disociación mecánica adicional y/o una extracción con alcohol para eliminar el lípido residual de los adipocitos42,43. Anteriormente hemos demostrado que esto se debe a que, si bien la descelularización con SDS elimina la IMCL, evita la gran gota de lípidos en los adipocitos37. Las imágenes del músculo intacto tetroxido de osmio antes y después de la descelularización con μCT verificaron que el patrón espacial de IMAT no se vio interrumpido por la descelularización. Además, la cuantificación de triglicéridos intramusculares en un músculo descelularizado con IMAT insignificante fue de ~5% de los valores musculares intactos, verificando la eliminación de IMCL. Por lo tanto, esta metodología retiene las gotas lipídicas de IMAT en su distribución anatómica original a través de una matriz muscular semitransparente.

La descelularización adecuada es el paso más crítico de este protocolo. Si la descelularización es incompleta, las gotas lipídicas de IMAT serán difíciles de visualizar y el IMCL residual causará una alta tinción de fondo con ORO o BODIPY (Figura 2). Los errores más comunes de los usuarios inexpertos son la cobertura inadecuada de SDS por músculo (dentro de cada pocillo), de modo que cada músculo no está completamente cubierto por la solución de SDS, no utilizar un balancín para agitar la solución durante la descelularización y no realizar cambios de solución con la suficiente frecuencia. En este manuscrito, hemos recomendado la cantidad de SDS necesaria por unidad de masa muscular, pero el usuario aún deberá asegurarse de que los músculos estén completamente cubiertos por soluciones, ya que cada músculo tiene una geometría única. También se recomienda a los usuarios que cambien las soluciones generosamente (hasta dos veces al día) para asegurarse de que la descelularización sea completa. Se ha logrado una tinción de buena calidad de las gotas de lípidos IMAT después de hasta 4 días de tratamiento con SDS. Para obtener resultados de tinción de ORO de alta calidad, también es importante una fijación adecuada y una preparación de la solución de ORO. Al igual que el tratamiento con SDS descrito anteriormente, se necesita una cobertura adecuada de una solución de formaldehído al 3,7% para cada muestra muscular. Si el músculo se retira del fijador demasiado pronto, las gotas de lípidos solo se tiñirán débilmente con ORO. Un total de 1-2 h debería ser suficiente, pero se recomienda la fijación durante la noche para garantizar que el fijador penetre en el centro del músculo y fije completamente todas las gotas de lípidos. Un desafío adicional con la tinción de ORO es que cuando la concentración de alcohol se reduce al 60%, comienza a formarse una partícula. Esta partícula puede depositarse en la superficie y atascarse en el borde del músculo. La mejor manera de evitar esto es hacer una nueva solución de trabajo para cada tinción y usar filtros de malla de 40 μm y 0,22 μm. Luego, mantener la agitación con el balancín y limitar el tiempo de tinción a 10 minutos ayudará a evitar que se asiente cualquier partícula que se forme. Si el problema persiste, hacer una nueva solución madre de ORO puede ayudar. Si algún artefacto permanece pegado a la superficie muscular descelularizada, se puede usar un microscopio estereoscópico, fórceps y tijeras quirúrgicas para extraer este artefacto. Si no se eliminan los artefactos, se afectará a la calidad de la imagen de los músculos y se sobrestimará el contenido de IMAT durante la parte de extracción de lípidos en preparación para la lectura de la OD.

En general, esta técnica es sencilla y ofrece varias ventajas sobre los métodos de referencia para visualizar y cuantificar la infiltración grasa del músculo esquelético. Las técnicas no invasivas, como la tomografía computarizada, la resonancia magnética y la ecografía, que se utilizan ampliamente en humanos y, a veces, en modelos animales, tienen una resolución espacial limitada y no pueden distinguir las gotas de lípidos de las fibras musculares. Por lo tanto, un píxel o vóxel de intensidad de señal intermedia se asigna como "músculo" o "grasa", mientras que en realidad es probable que sea una mezcla de miofibras y adipocitos. Más comúnmente, la infiltración grasa en el músculo animal se evalúa mediante histología, con mayor frecuencia mediante ORO en criosecciones musculares. Sin embargo, esto generalmente solo se realiza en una sola sección representativa y es difícil de cuantificar debido a la dispersión de lípidos en la sección. Por el contrario, la tinción con ORO de todo un músculo descelularizado proporciona una evaluación completa de IMAT con costos y esfuerzo similares a los de la morfología intacta. Además, además de mejorar la visualización, la tinción ORO de la descelularización permite cuantificar la infiltración grasa mediante extracción lipídica. Para profundizar en las características de la infiltración grasa, se puede utilizar una tinción fluorescente, BODIPY, junto con la microscopía confocal. Esto permite la reconstrucción de gotas de lípidos IMAT individuales para mapear el paisaje 3D, lo que no es posible con la histología a menos que se analicen secciones a lo largo del músculo. Si bien un microscopio confocal no es un equipo de laboratorio estándar, es más probable que sea accesible en un entorno universitario o industrial que la resonancia magnética o la tomografía computarizada de animales pequeños. Además, gran parte de este proceso se puede automatizar, lo que reduce el costo de tiempo en comparación con la histología secuencial. La optimización de la configuración en el microscopio confocal es una consideración adicional para la tinción BODIPY. Estos son únicos para cada microscopio. El valor crítico es la intensidad del láser, que debe ser lo suficientemente alta como para detectar las gotas de lípidos en la superficie distante del músculo y, al mismo tiempo, no saturar la señal de las gotas de lípidos en el lado cercano. Debido a esto, se sugiere que el uso de la tinción BODIPY con microscopía confocal es más adecuado en los músculos más delgados, incluido el EDL o el diafragma.

Varias limitaciones de este enfoque merecen ser discutidas. En primer lugar, si bien se anticipa que esta técnica tiene una amplia aplicabilidad más allá de los modelos de lesión (cardiotoxina y glicerol) en ratones presentados aquí, las nuevas aplicaciones (por ejemplo, el modelo mdx) pueden requerir optimización, ya que el tamaño y la composición del músculo (por ejemplo, la fibrosis) podrían afectar la descelularización, lo que requeriría una mayor concentración de SDS o tiempos de incubación. Otros modelos de enfermedad con masa muscular alterada también requerirían el análisis de métricas absolutas y normalizadas (a la masa muscular) de infiltración grasa para determinar la cantidad absoluta de lípidos o el porcentaje de lípidos en relación con el volumen muscular para proporcionar una medida de resultado más significativa. Además, se prevé que esta técnica sea ampliamente aplicable a modelos animales más grandes y biopsias humanas, pero esto puede requerir una optimización para cada nueva aplicación. En segundo lugar, en esta estrategia, todo el músculo debe dedicarse a este ensayo y no puede utilizarse para evaluar otra característica patológica. Los estudios que tienen como objetivo evaluar los cambios longitudinales en el IMAT se realizan mejor con técnicas de imagen no invasivas y los estudios cuyo objetivo principal requiere el músculo para otros fines (histología, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, Western blot) se realizan mejor mediante la evaluación histológica, ya que el resto del músculo congelado se puede asignar a otros ensayos. Sin embargo, este ensayo es muy adecuado para combinarse con ensayos in vivo, como correr en cinta rodante o ensayos contráctiles ex vivo , ya que estas medidas pueden realizarse antes de la descelularización44. En tercer lugar, aunque el uso de la tinción BODIPY con microscopía confocal proporciona una visualización y cuantificación de alta resolución de las gotas de lípidos, no puede identificar de manera concluyente las gotas de lípidos como adipocitos individuales, ya que se elimina la membrana celular y se pierden las proteínas endógenas de los adipocitos. Los adipocitos multiloculares, que representan adipocitos inmaduros o un fenotipo "marrón/beige", pueden identificarse como gotas de lípidos múltiples. Por último, el protocolo no funciona bien en el músculo previamente congelado. Estas limitaciones son probablemente más profundas en el caso de las biopsias humanas, ya que si bien toda la biopsia se puede descelularizar, no es probable que la distribución espacial de IMAT en la biopsia sea más representativa de todo el músculo que un corte histológico. Sin embargo, dado que esta técnica es relativamente insensible a las condiciones de manipulación de la biopsia no congelada (p. ej., horas en hielo en PBS), la biopsia podría dividirse posteriormente para varios ensayos, incluida una parte para la descelularización, lo que proporcionaría una mejor resolución de las gotas de lípidos individuales.

En conclusión, se ha desarrollado un método novedoso para el análisis cualitativo y cuantitativo de la infiltración grasa del músculo esquelético mediante la tinción y obtención de imágenes de los lípidos retenidos de las construcciones descelularizadas. Esta metodología ofrece mejoras con respecto a los enfoques de referencia, ya que permite obtener imágenes completas de la infiltración grasa tridimensional dentro del músculo y una cuantificación rápida y barata con tinción de ORO. Para mediciones más detalladas, una segunda tinción de BODIPY soluble en lípidos proporciona una cuantificación más detallada del número, el volumen y el patrón de distribución de las gotas lipídicas, según las imágenes de la microscopía confocal. Juntas, estas medidas proporcionan a los investigadores una forma de medir con precisión la infiltración de grasa del músculo esquelético a nivel de las gotas de lípidos individuales sin tomar muestras ni obtener imágenes no invasivas costosas.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de R01AR075773 a GAM.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Syringe FilterFisher ScientificSLGP033RS
1 mL LuerLock SyringesFisher Scientific14823434
12 mm CoverslipsFisher Scientific12545F
12 well platesFisher Scientific08-772-29
24 well platesFisher Scientific08-772-1H
2-Propanol (Isopropanol)Sigma AldrichI95160.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month.  Working solution must be made fresh.
37% Formaldehyde SolutionSigma Aldrich8187081000
40 µm Mesh FilterFisher Scientific87711
6 well platesFisher Scientific08-772-1B
96 well platesFisher Scientific08-772-2C
BODIPY 493/503Fisher ScientificD-3922
C57BL/6J MiceJackson Laboratory000664
Confocal Imaging DishVWR734-2905
Confocal MicroscopeLeicaTCS SPEII
Dissecting/stereo MicroscopeZeiss4107009123001000
Dissection scissorsFine Science Tools14060-09
Dumont #5 forcepsFine Science Tools11254-20
EthanolFisher Scientific033361.K2
ImageJNIH
MatlabMathworks
Oil Red O PowderSigma AldrichO0625
Plate readerBio-tekSynergy II 
Rocker/ShakerReliable Scientific55D
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Sigma AldrichL37711% Solution can be stored at room temperature for 1 month
Transfer pipettesFisher Scientific137119D
Vannas spring scissorsFine Science Tools15000-00

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