Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) con un Componente Inmune

Resumen

Aquí describimos la construcción de un sistema modelo básico tridimensional (3D) de líneas celulares intestinales y un protocolo de inclusión de parafina para la evaluación microscópica óptica de equivalentes intestinales fijos. La tinción de proteínas seleccionadas permite el análisis de múltiples parámetros visuales de un solo experimento para su uso potencial en estudios preclínicos de detección de fármacos.

Resumen

Ha aumentado el uso de modelos intestinales in vivo e in vitro para estudiar la fisiopatología de las enfermedades inflamatorias intestinales, para el cribado farmacológico de sustancias potencialmente beneficiosas y para los estudios de toxicidad de componentes alimentarios potencialmente nocivos. Cabe destacar que existe una demanda actual para el desarrollo de modelos in vitro basados en células que sustituyan a los modelos animales. Aquí, se presenta un protocolo para un modelo básico de equivalente intestinal tridimensional (3D) de "tejido sano" utilizando líneas celulares con el doble beneficio de proporcionar simplicidad experimental (sistema estandarizado y fácilmente repetible) y complejidad fisiológica (enterocitos Caco-2 con un componente inmune de soporte de monocitos U937 y fibroblastos L929). El protocolo también incluye la inclusión en parafina para la evaluación microscópica de luz de equivalentes intestinales fijos, lo que proporciona la ventaja de analizar múltiples parámetros visuales a partir de un solo experimento. Para verificar la eficacia del modelo como sistema experimental se utilizan cortes teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) que muestran las células cilíndricas de Caco-2 formando una monocapa apretada y regular en tratamientos de control. Utilizando el gluten como componente alimentario proinflamatorio, los parámetros analizados en las secciones incluyen la reducción del grosor de la monocapa, así como la disrupción y el desprendimiento de la matriz subyacente (H&E), la disminución de la expresión de la proteína de unión estrecha como se muestra en la tinción de ocludina (cuantificable estadísticamente) y la activación inmune de las células U937 migratorias como se evidencia en la tinción del grupo de diferenciación 14 (CD14) y la diferenciación relacionada con CD11b en macrófagos. Como se muestra mediante el uso de lipopolisacáridos para simular la inflamación intestinal, los parámetros adicionales que se pueden medir son el aumento de la tinción de moco y la expresión de citocinas (como la midquina) que se pueden extraer del medio antes de la fijación. El modelo básico tridimensional (3D) de la mucosa intestinal y las secciones fijas pueden recomendarse para estudios de estado inflamatorio e integridad de la barrera con la posibilidad de analizar múltiples parámetros visuales cuantificables.

Introducción

La barrera epitelial intestinal, un revestimiento interno de una célula de espesor que contiene diferentes tipos de células epiteliales, constituye la primera barrera o interfaz defensiva física entre el medio externo e interno del cuerpo ^1,2. Los enterocitos de tipo cilíndrico constituyen el tipo más abundante de células epiteliales. Estos son responsables de mantener la integridad de la barrera epitelial a través de las interacciones entre varios componentes de la barrera, incluidas las uniones estrechas (TJ), desempeñando un papel importante en el endurecimiento de la barrera ^1,....

Protocolo

1. Preparación del modelo básico de mucosa intestinal reconstruida en 3D

NOTA: Todo el procedimiento debe realizarse en una campana de flujo laminar estéril. Todas las etapas del procedimiento que impliquen el uso de la incubadora celular significan que los cultivos se incuban a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene un 5% de_CO2 (a menos que se indique lo contrario en el protocolo_).

1. Preparación previa de las líneas celulares utilizadas en el sistema modelo intestinal
   1. Siembre células de fibroblastos de ratón L929 a una concentración de 5 x 10^{5 en} 5 mL del Medio Eagle Modificado (DME....

Discusión

El sistema modelo básico de mucosa intestinal reconstruida que se presenta aquí (Figura 6) combina la complejidad fisiológica (cultivos celulares 3D más relevantes desde el punto de vista fisiológico que contienen una monocapa de Caco-2 con un soporte de lámina propia rica en MEC que contiene fibroblastos y monocitos) con la simplicidad experimental (utilizando líneas celulares humanas comerciales para producir un sistema estandarizado y fácilmente repetible)¹³