Efecto Analgésico de Tuina en Modelos de Ratas con Compresión del Dolor del Ganglio de la Raíz Dorsal

Resumen

En este artículo se presenta una manipulación para el tratamiento de la compresión crónica del ganglio de la raíz dorsal en ratas mediante terapia de Tuina, junto con un método para evaluar su efectividad basado en el comportamiento del dolor y los resultados histopatológicos.

Resumen

El dolor neuropático es una afección prevalente que afecta al 6,9%-10% de la población y es el resultado de un daño nervioso debido a diversas etiologías, como la hernia discal lumbar, la estenosis del canal espinal y la estenosis del foramen intervertebral. Aunque Tuina, una terapia manual tradicional china, ha demostrado efectos analgésicos en la práctica clínica para el tratamiento del dolor neuropático, sus mecanismos neurobiológicos subyacentes siguen sin estar claros. Los modelos animales son esenciales para dilucidar los principios básicos de Tuina. En este estudio, proponemos un protocolo estandarizado de Tuina para ratas con compresión del ganglio de la raíz dorsal (GRD), que consiste en inducir la compresión de la GRD mediante la inserción de una varilla de acero inoxidable en el foramen intervertebral, realizar la manipulación de Tuina con parámetros específicos de localización, intensidad y frecuencia en un ambiente controlado, y evaluar los resultados conductuales e histopatológicos del tratamiento con Tuina. Este artículo también discute las posibles implicaciones clínicas y limitaciones del estudio y sugiere direcciones para futuras investigaciones sobre Tuina.

Introducción

En el ámbito clínico, es frecuente observar dolor patológico neurológico causado por la compresión de la raíz nerviosa debido a diversos motivos. La forma más típica de este dolor neuropático es la hernia discal lumbar (LDH), que suele ser persistente, recurrente y difícil de curar. Aproximadamente el 9% de la población mundial se ve afectada por la LDH, lo que conlleva importantes cargas sociales y económicas¹. La incidencia de este tipo de dolor neuropático aumenta cada año, con tendencia hacia pacientes más jóvenes, debido a los cambios en la producción humana y en el estilo de vida². A pesar del uso de analgésicos no esteroideos, los síntomas de los pacientes no pueden aliviarse por completo. Como resultado, las terapias alternativas, como Tuina, para tratar el dolor causado por la LDH han ganado cada vez más atención.

La terapia Tuina, una forma de tratamiento conservador para la LDH, es ampliamente recomendada en varias guías de práctica clínica en todo el mundo para prevenir y tratar el dolor lumbar ^3,4. La investigación ha demostrado que Tuina puede reducir significativamente los factores inflamatorios como la IL-6 sérica y los niveles de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en pacientes con LDH, al tiempo que mejora el dolor y el deterioro de la función lumbar de los pacientes⁵. Sin embargo, el mecanismo específico detrás de los efectos analgésicos de la terapia Tuina sigue sin estar claro.

Los modelos animales son una herramienta valiosa para estudiar el dolor neuropático causado por la LDH⁶. Permiten realizar mediciones conductuales para evaluar la eficacia de la terapia con Tuina y proporcionar muestras de la fisiología patológica de la LDH. Por ejemplo, se pueden tomar muestras de los ganglios de la raíz dorsal en el muslo para verificar los cambios en las células ganglionares de la raíz dorsal. La compresión crónica del modelo del Ganglio de la Raíz Dorsal (DCC) se utiliza comúnmente para evaluar la fisiología patológica de la LDH, ya que causa daños en la morfología de las células ganglionares de la raíz dorsal que son consistentes con los cambios patológicos observados en los casos clínicos de compresión nerviosa causada por hernia discal⁷.

Muchos estudiosos han llevado a cabo varios experimentos con animales sobre la analgesia de acupresión ^8,9,10. Sin embargo, cuando se implementan operaciones de acupresión en modelos animales, a menudo imitan la acupresión humana. El efecto terapéutico de la acupresión se ve afectado por factores como el tamaño, la frecuencia y la dirección de la fuerza aplicada^11,12,13. Si el experimento carece de un estándar unificado de acupresión, como la fuerza, la frecuencia y la duración de la operación, esto puede causar alguna desviación en los resultados experimentales. Este artículo presenta un conjunto de planes de tratamiento de acupresión basados en las características de las ratas CCD, y promueve el desarrollo de operaciones de acupresión estandarizadas en modelos animales.

Protocolo

Este trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio del Dolor del Instituto de Neurobiología de la Universidad de Fudan. Los experimentos fueron aprobados y se adhirieron estrictamente a las pautas para la protección de animales de laboratorio establecidas por la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (LASP) para todos los procedimientos quirúrgicos y el manejo de animales. Para el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (SD) de grado limpio, compuestas por 32 machos de entre 40 y 50 días de edad, con un peso promedio de 220 ± 1,38 g. Estas ratas se obtuvieron del Centro de Animales Experimentales de la Academia de Ciencias de la Vida de Shanghái, Academia China de Ciencias. Los animales fueron debidamente cuidados y alojados en una sala dedicada con ventilación independiente, temperatura regulada (22 ± 1 °C) y humedad (40%-50%). Las ratas tenían acceso a comida y agua adecuadas en sus jaulas. La sala de animales de laboratorio siguió un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas para mantener la regularidad de los ritmos circadianos de las ratas, y el personal designado reemplazó regularmente el acolchado. La radiografía se realizó en el Departamento de Radiología del Hospital Integrado de Medicina Tradicional China y Occidental de Yueyang, afiliado a la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái.

1. Participantes del estudio y agrupación

1. Asigne 32 ratas a cuatro grupos: ingenuas (control), simuladas (operación simulada), CCD (compresión crónica del ganglio de la raíz dorsal) y CCD + Tuina (8 ratas/grupo). Las ratas tenían libre acceso a comida y agua en las instalaciones para animales.
   NOTA: Las ratas ingenuas no fueron intervenidas, mientras que el grupo simulado se sometió al mismo procedimiento quirúrgico que las ratas del grupo CCD, pero sin dejar una varilla de acero inoxidable en forma de "L" en el foramen intervertebral L4 y L5. Las ratas del grupo CCD se sometieron a una cirugía modelo de compresión crónica crónica del ganglio de la raíz dorsal. Las ratas del grupo CCD + Tuina recibieron terapia con tuina a partir del cuarto día después de la cirugía CCD.

2. Establecimiento del modelo animal

1. Administrar isofluorano para anestesiar ratas. Una vez que las ratas pierdan el conocimiento (sin reflejo de movimiento de la cola o reflejo de flexión de las piernas), afeiten el vello en el área quirúrgica con una navaja.
   NOTA: Se aplicaron fármacos analgésicos 15 min antes de la cirugía y se inyectó tramadol 20 mg/kg en ratas por vía subcutánea.
2. Asegure a la rata en una tabla de espuma (consulte la Tabla de materiales) y use bandas elásticas para asegurar sus extremidades e incisivos. Limpie el área preparada con una preparación estéril de alcohol y yodo durante un mínimo de 3 ciclos.
3. Inserte la sonda en forma de "L" (consulte la Tabla de materiales).
   1. Use tijeras para hacer una incisión de 2-3 cm a través de la piel, la fascia superficial y la fascia profunda capa por capa. En primer lugar, localiza la espina ilíaca anterosuperior, que corresponde a la quinta columna lumbar. Luego, localiza secuencialmente la tercera y cuarta apófisis espinosas.
   2. Sujete la apófisis espinosa con pinzas dentadas y levántela para permitir que las tijeras estén cerca del lado derecho de la apófisis espinosa y corte el músculo unido al lado derecho de la apófisis espinosa.
   3. Luego, diseccione sin rodeos el músculo unido a la superficie externa de la placa vertebral hasta que haya resistencia en el lado derecho. La protuberancia es la articulación zigapofisiaria. Del mismo modo, diseccione sin rodeos el músculo y la fascia en la articulación zigapofisiaria.
      NOTA: La apófisis transversal que apunta a la dirección de la cabeza de la rata se tocará primero en la parte frontal exterior inferior de la articulación zigapofisiaria. Debajo de la apófisis transversa se encuentra el agujero intervertebral, que está lleno de raíces nerviosas y tejidos blandos circundantes y no suele ser fácil de encontrar.
   4. Primero, use una sonda en forma de "L" para determinar la posición del agujero intervertebral y luego use una varilla de acero inoxidable en forma de "L" (que debe fabricarse con un diámetro de 0,4 mm y una longitud de 4 mm) para insertarla en el agujero intervertebral.
   5. Si el ganglio de la raíz dorsal se comprime con éxito, la rata exhibirá un movimiento de la cola y un reflejo de flexión de la pata. Inserte la varilla de acero inoxidable en el cuarto y quinto agujero intervertebral lumbar. Luego, sutura (3-0, ver Tabla de Materiales) el músculo, la fascia y la piel capa por capa.
4. Coloca a la rata en una caja termostática hasta que se despierte. Después de despertarse, observe si la función de la extremidad trasera derecha de la rata es normal. Si hay arrastre, significa que la operación ha lesionado los nervios motores y la rata debe descartarse. Si la función de la extremidad trasera derecha es normal, la rata puede ser utilizada y colocada en una jaula para alimentarse.

3. Terapia Tuina

1. Establecer un ambiente cómodo: antes de iniciar la terapia con Tuina, aclimatar a la rata en el inmovilizador durante 30 minutos para que se adapte (Figura 1). Este dispositivo puede exponer completamente el muslo de la rata e inmovilizarlo, facilitando las maniobras de Tuina (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: La temperatura en la sala de tratamiento debe mantenerse entre 22 y 26 °C y la humedad debe estar entre el 40% y el 50%.
2. Estandarización de Tuina: asegúrese de que los terapeutas usen fundas inalámbricas para los dedos que puedan monitorear la presión y la frecuencia de Tuina y proporcionar datos de retroalimentación en tiempo real. Primero, practica Tuina con los datos de retroalimentación de los manguitos de los dedos, ajustando la fuerza a 5 N y la frecuencia a 2 Hz. Luego, realice las mismas maniobras en las ratas, manteniendo una fuerza y frecuencia constantes durante todo el procedimiento (Figura 2).
   NOTA: Con base en nuestro trabajo anterior, la fuerza de presión óptima calculada es de 5 N (consulte la sección Discusión para obtener más detalles).
3. Identificar el punto de acupuntura: seleccionar el músculo gastrocnemio de la extremidad posterior derecha como el área Tuina de la rata, en la unión de las dos cabezas del músculo gastrocnemio, aproximadamente en la ubicación de BL57¹⁴.
4. Realizar la Tuina: asegúrese de que el terapeuta mire hacia la cara posterior del muslo de la rata y sujete la extremidad posterior derecha de la rata con su extremidad superior derecha. Coloque el pulgar verticalmente en el punto de acupuntura BL57 y asegúrese de que el antebrazo y los dedos ejerzan fuerza para realizar un movimiento giratorio rítmico de pequeño rango mientras aplica una presión de 5 N (Figura 3).
5. Durante el tratamiento, asegúrese de que la fuerza y la frecuencia de la retroalimentación de manipulación se correspondan con los valores preestablecidos. Iniciar la intervención a partir del cuarto día después de la cirugía, con Tuina realizada una vez al día durante 15 min, de forma continuada durante 18 días.

4. Pruebas conductuales para el dolor

NOTA: Las pruebas de comportamiento se realizaron antes del modelado, después del modelado, el día 1 de la intervención, el día 3 de la intervención, el día 7 de la intervención, el día 14 de la intervención, el día 17 de la intervención y el día 21 de la intervención.

1. Realice el umbral de respuesta de estimulación mecánica (umbral de retirada de patas, PWT) siguiendo los pasos que se indican a continuación (Figura 4).
   1. Utilice el método de von Frey para probar el umbral de respuesta de la estimulación mecánica en las patas de las ratas. Coloque las ratas en un compartimento de vidrio templado transparente de 20 cm × 10 cm × 20 cm, que se colocó en un soporte de rejilla de alambre metálico con aberturas de 10 mm × 10 mm a una altura de 40 cm. Mantenga la temperatura ambiente entre 23 ± 2 °C y el entorno circundante en silencio.
   2. Mida el umbral de extracción mecánica con fibras electrónicas de Von Frey (consulte la tabla de materiales). Estimula el centro de la pata de la rata hasta que se mueva notablemente, como levantar la pata o evitarla. La máquina registra automáticamente el valor máximo de presión (N).
   3. Espere 15 s o más antes de volver a estimular a la misma rata. Mantenga cada estimulación por debajo de los 5 segundos para evitar la sensibilización táctil en las patas de la rata. Repita la prueba cinco veces hasta que las tres mediciones consecutivas difieran en menos de 10 N.
2. Realice la latencia de retirada de la pata (PWL) en respuesta a la estimulación térmica (Figura 5).
   1. Evaluar el PWL mediante el método de Hargreaves^15,16. Coloque las ratas en una pequeña cámara hecha de vidrio templado transparente, que mida 20 cm x 10 cm x 20 cm, con una tapa de vidrio transparente con un orificio de ventilación. Calentar la zona central de la tapa de cristal a 45 °C con una placa calefactora hasta que alcance una temperatura estable.
   2. Durante la fase de prueba de comportamiento, aclimate a las ratas al laboratorio de comportamiento durante al menos 2 horas cada día para minimizar el impacto de los factores ambientales en los resultados de la prueba.
   3. Antes de la prueba formal, coloque a las ratas en el laboratorio de comportamiento durante 30 minutos para permitirles adaptarse al entorno y reducir la interferencia.
   4. Caliente la placa calefactora a 45 °C y coloque las extremidades traseras de la rata sobre la placa calefactora.
   5. La latencia de retirada de la pata (PWL) se definió como el tiempo transcurrido desde el inicio del calentamiento hasta la aparición del reflejo de retirada de la pata en respuesta a la estimulación térmica. En cada prueba, pruebe la misma extremidad posterior tres veces seguidas y el valor promedio para obtener la latencia de respuesta de esa extremidad posterior. Después de la prueba, regrese a las ratas a sus jaulas para que se alimenten.

5. Perfusión

1. Preparación: preparar previamente una solución salina al 0,9% y una solución de paraformaldehído al 4%. Coloque la solución salina en un horno a una temperatura constante de 37 °C y almacene la solución de paraformaldehído en un refrigerador a 4 °C para su uso posterior.
2. Realizar la anestesia y establecer el acceso.
   1. Comience inyectando uretano al 25% (0,6 ml/100 g, consulte la tabla de materiales) en la cavidad abdominal de la rata para inducir una anestesia profunda. Espere hasta que no se observe ningún reflejo de los dedos de los pies, de la córnea o de giro. Fija la rata en una tabla de espuma.
   2. Corta el esternón con unas tijeras y abre la piel y la fascia capa por capa. Corta el diafragma y corta las costillas de ambos lados para exponer completamente el corazón. Separe cuidadosamente el pericardio. Separe los pulmones del corazón.
   3. Use fórceps para tirar y exponer la aorta tirando del corazón hacia uno mismo. Alinee la aguja, el ventrículo izquierdo y la aorta en línea recta y en el mismo plano horizontal. Luego, inserte la aguja desde el ventrículo izquierdo en la aorta hasta que la aguja sea visible dentro de la aorta.
   4. Use fórceps para sujetar la aorta y la aguja dentro de la aorta, y luego abra la aurícula izquierda con unas tijeras. En este momento, una gran cantidad de sangre saldrá a borbotones de la aurícula izquierda. Abra la válvula de la solución salina y conecte la inyección de solución salina para perfundir solución salina a 37 °C, para un total de aproximadamente 150-200 ml.
3. Una vez completada la perfusión salina, cambiar a la solución de paraformaldehído al 4% y perfundir con una solución de paraformaldehído al 4% para un total de aproximadamente 400 ml a 4 °C. Al iniciar la perfusión de paraformaldehído, sostenga los dientes frontales de la rata con un par de pinzas y tire de ellos hacia adelante, mientras sostiene la cola con una mano y tira de ella hacia atrás, lo cual es ventajoso para extender completamente la columna vertebral y aumentar el agujero intervertebral para facilitar la toma de muestras de GRD.
4. Durante la perfusión, el hígado, el mesenterio y el epiplón mayor de la rata se vuelven pálidos gradualmente hasta que el hígado se vuelve rígido. Luego, disminuya la velocidad del flujo y ajústelo a aproximadamente 2 gotas por segundo hasta que todo el paraformaldehído esté perfundido.

6. Colección de ganglios de la raíz dorsal

NOTA: Después de la perfusión, corte rápidamente la sección lumbar de la columna vertebral de la rata. Localice el foramen intervertebral L5 y L4 conectando los puntos más altos de la cresta ilíaca en ambos lados con la apófisis espinosa lumbar L5 utilizando este método de posicionamiento, y retire el ganglio de la raíz dorsal del agujero intervertebral. El método de recolección específico es el siguiente:

1. Desde la entrada del canal espinal (canal espinal torácico), inserte las tijeras en el canal espinal y corte la lámina en ambos lados hasta que se puedan eliminar todas las láminas por completo, exponiendo todo el canal espinal.
   NOTA: Tenga cuidado de no dañar la médula espinal y las raíces nerviosas fuera del canal espinal al cortar las láminas.
2. Retire con cuidado la médula espinal y el ligamento longitudinal posterior. Separe la duramadre unida al orificio interno del agujero intervertebral.
3. Use pinzas oftálmicas para sujetar y sacar el ganglio de la raíz dorsal, que tiene forma de perla y es ligeramente amarillento.
   NOTA: Debido a la fragilidad y la poca dureza del tejido nervioso, es necesario agarrar la fuerza y la dirección de tracción al sacar el ganglio de la raíz dorsal y no usar la fuerza bruta.
4. Al extraer el ganglio de la raíz dorsal, asegúrese de limpiar los tejidos blandos circundantes, incluida la duramadre y la aracnoides, con anticipación para facilitar el tirón suave del ganglio de la raíz dorsal.
5. Coloque el ganglio de la raíz dorsal sobre papel absorbente, corte el axón con una cuchilla y limpie los vasos sanguíneos en la superficie del ganglio de la raíz dorsal.
6. Después del recorte, pesar el ganglio de la raíz dorsal y sumergirlo en una solución de paraformaldehído al 4% con una concentración del 4% y una temperatura de 4 °C durante el tiempo suficiente, generalmente alrededor de 2-4 h, luego transferir el ganglio de la raíz dorsal a una solución de sacarosa PB al 10%, 20% y 30% (4 °C) preparada de antemano para la deshidratación escalonada.

7. Crioseccionamiento

1. Comience colocando el ganglio de la raíz dorsal en una solución de PBS de 0,01 M. Agítalos durante 10 minutos y luego lava la solución de sacarosa. Recorte con cuidado las fibras axónicas de ambos segmentos de los ganglios de la raíz dorsal. Limpie el cabezal de congelación de la máquina crioseccionadora y agréguele el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (consulte la Tabla de materiales).
2. Coloque el cabezal de congelación en la superficie de una carcasa de metal que contenga nitrógeno líquido, espere hasta que el tejido esté congelado, retírelo y recórtelo. Después de eso, coloque el cabezal de congelación en la base de la cortadora. El grosor de las rodajas de los ganglios de la raíz dorsal debe ser de 15 mm. Coloque las secciones finas cortadas en rodajas en una caja de madera en orden y guárdelas en un refrigerador a -20 ° C, lejos de la luz.

8. Tinción de hematoxilina y eosina

1. Coloque las secciones 2 min en xileno y deshidrételas en una serie de alcoholes, incluyendo 100%, 95%, 80% y 70%, durante 2 min cada una. Luego coloque las secciones 2 min en agua destilada, 1 min en hematoxilina, realice 5 min de enjuague con agua del grifo y realice la diferenciación en una solución salina al 1% durante 30 s, seguido de 30 s en carbonato de litio saturado.
2. A continuación, coloque las rodajas 2 min cada una en agua destilada y agua del grifo, 5 min en solución de eosina (0,5%), un enjuague rápido de 1 min en agua destilada, dos rondas de 2 min cada una en alcohol al 95% y 100%, 30 s en xileno al 100% con bicarbonato de sodio añadido, tres rondas de 3 min cada una en xileno y, finalmente, sellar con bálsamo neutro (ver Tabla de Materiales).

Resultados

La terapia con Tuina puede ayudar a disminuir los umbrales de estimulación mecánica y térmica de las ratas causados por el modelado CCD
Después de 17 días de tratamiento con Tuina, se observó una diferencia significativa en los umbrales de PWT entre las ratas con DCC que recibieron tratamiento con Tuina y el grupo con DCC no tratado (P = 0,021, <0,05) (Figura 6 y Tabla 1).

Las ratas del grupo CCD que recibieron t...

Discusión

Nuestro grupo de investigación ha realizado estudios relevantes sobre los parámetros de la manipulación de Tuina en etapas tempranas. En primer lugar, es importante establecer la intensidad de la fuerza para la manipulación de Tuina. En la Tuina clínica, los profesionales ajustan la intensidad de la fuerza de acuerdo con su experiencia y los sentimientos subjetivos de los pacientes, logrando el mejor efecto Tuina a través de la comunicación. Sin embargo, esto no es factible en experimentos con animales. En experim...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
"L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter)	hand-made	/	For CCD models making
ALMEMO admeasuring apparatus	ahlborn	2450-1	Mechanical Withdrawal Threshold test
Constant temperature slicer CM-1900	Leica	1491950C1US	For specimen production
Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle	LIRCON/Shandong Lilkang	/	For disinfection
Disposable sterile syringe 5 mL	Shanghai Misha Wa Medical Industry	/	For injection
Electron microscope CX-31	Olympus, Japan	BJ002318	For specimen observation
Finger pressure recordings	Suzhou Changxian Optoelectronic Technology	CX1003w	For Tuina manipulation
Foam board (35 cm x 20 cm)	hand-made	/	It is our homemade apparatus for fixing rats
MERSILK W2512	Johnson & Johnson	/	For tissue suture
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent	10004160	For specimen production
paraformaldehyde	China National Chemical Reagent	/	For specimen production
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	For anesthesia of rat
Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats	IITC Life Science	/	Paw Withdrawal Latency
Precision electronic scale for experiment JY3002	Shanghai Precision Scientific Instrument	/	Weighing of rat
Rat hair clipper	Philips	HP6341/00	Shaving of rat fur
Restrainer for rats	Tongji University (self-made)	/	It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583	For specimen production
Uratan	China National Chemical Reagent	/	For anesthesia of rat
X-ray detector XR-600	Dongguan Kaso Electronic Technology	/	Examination of CCD models
xylene	Shanghai Sinopharm Group	100092	For specimen production