Hibridación in situ de fluorescencia de ARN para la localización de ARN no codificante largo en células de osteosarcoma humano

Resumen

El presente protocolo describe un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN para localizar los lncRNAs en células de osteosarcoma humano.

Resumen

Se han estudiado las funciones importantes de los ARN largos no codificantes (ARNnc) en el cáncer, como la regulación de la proliferación, la transición epitelio-mesenquimal (EMT), la migración, la infiltración y la autofagia de las células cancerosas. La detección de localización de lncRNAs en las células puede proporcionar información sobre sus funciones. Mediante el diseño de la secuencia de cadena antisentido específica de lncRNA seguida de marcaje con colorantes fluorescentes, se puede aplicar la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para detectar la localización celular de lncRNAs. Junto con el desarrollo de la microscopía, las técnicas de ARN FISH permiten ahora incluso la visualización de los lncRNAs mal expresados. Este método no solo puede detectar la localización de lncRNAs por sí solo, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas mediante el uso de inmunofluorescencia bicolor o multicolor. Aquí, hemos incluido el procedimiento de operación experimental detallado y las precauciones de ARN FISH mediante el uso del gen huésped de ARN nucleolar pequeño de lncRNA 6 (SNHG6) en células de osteosarcoma humano (143B) como ejemplo, para proporcionar una referencia para los investigadores que desean realizar experimentos de ARN FISH, especialmente lncRNA FISH.

Introducción

Nuestra comprensión del genoma humano se ha ampliado enormemente gracias a los recientes avances en la tecnología del genoma completo. Alrededor del 93% del genoma humano se puede transcribir en ARN, pero solo el 2% de los ARN se pueden traducir en proteínas; el 98% restante de los ARN que no tienen función de traducción de proteínas se denominan ARN no codificante (ncRNA)¹. Como una clase de ARN no codificantes (ncRNAs), los ncRNAs largos (lncRNAs), que contienen más de 200 nucleótidos², han atraído cada vez más atención debido a su participación en muchos procesos fisiológicos y patológicos de las células, como la dife....

Protocolo

Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo. La Figura 1 muestra el protocolo general para ARN FISH; La Tabla 1 contiene la composición de todas las soluciones y la Tabla 2 contiene las secuencias de cebadores utilizadas en este protocolo.

1. Preparación de la sonda

1. Identificar y adquirir la secuencia FASTA de un lncRNA diana de interés, por ejemplo, de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Siguiendo las indicaciones del sitio web, dise....

Discusión

Este protocolo RNA FISH no solo puede detectar la localización de lncRNAs en las células, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas en las células, que también se pueden utilizar para detectar la ubicación de lncRNAs en tejidos embebidos en parafina. Sin embargo, el protocolo específico en estos casos es diferente porque los tejidos embebidos en parafina necesitan ser desparafinados²¹. Este procedimiento experimental se puede aplicar en placas de 48 o 96 pocil.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
Cell culture plate-12	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	3513,corning	Place the coverslips in the plate
Cell line (143B)	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	CRL-8303	osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Coverslips	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	abs7026	The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe	Shanghai GenePharma Co.,Ltd	A10005	Detect SNHG6 location
DMEM media	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Cell culture medium
Dry Bath Incubator	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	DKT200-2	Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	10009218	dehydration
Fluorescence microscope	Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD	Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus	Observation and positioning
Incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD	DHP-9051	The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E675004	Attach the coverslips to the slide
Shaker	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	TS-8S	Washing sample
Slide	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	188105	The coverslips is placed on the slide
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600198	Permeable membrane and nuclear membrane
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells
Tween-20	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600560	detergent