Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

Resumen

La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.

Resumen

La terapia convencional de regeneración ósea con células madre mesenquimales (MSC) es difícil de aplicar a defectos óseos más grandes que el tamaño crítico porque no tiene un mecanismo para inducir la angiogénesis. La implantación de tejido cartilaginoso artificial fabricado a partir de MSC induce la angiogénesis y la formación ósea in vivo a través de la osificación endocondral (ECO). Por lo tanto, este enfoque mediado por ECO puede ser una terapia de regeneración ósea prometedora en el futuro. Un aspecto importante de la aplicación clínica de este enfoque mediado por ECO es el establecimiento de un protocolo para preparar suficiente cartílago para ser implantado para reparar el defecto óseo. Especialmente no es práctico diseñar una sola masa de cartílago injertado de un tamaño que se ajuste a la forma del defecto óseo real. Por lo tanto, el cartílago a trasplantar debe tener la propiedad de formar hueso de forma integral cuando se implantan múltiples piezas. Los hidrogeles pueden ser una herramienta atractiva para ampliar los injertos de ingeniería tisular para la osificación endocondral con el fin de cumplir con los requisitos clínicos. Aunque muchos hidrogeles de origen natural apoyan la formación de cartílago MSC in vitro y ECO in vivo, aún no se ha determinado el material de andamio óptimo para satisfacer las necesidades de las aplicaciones clínicas. El ácido hialurónico (AH) es un componente crucial de la matriz extracelular del cartílago y es un polisacárido biodegradable y biocompatible. Aquí, demostramos que los hidrogeles de HA tienen excelentes propiedades para apoyar la diferenciación in vitro del tejido cartilaginoso basado en MSC y promover la formación de hueso endocondral in vivo.

Introducción

El hueso autólogo sigue siendo el estándar de oro para reparar defectos óseos debidos a traumatismos, defectos congénitos y resección quirúrgica. Sin embargo, el injerto óseo autógeno tiene limitaciones significativas, incluyendo dolor del donante, riesgo de infección y volumen óseo limitado que puede ser aislado de los pacientes 1,2,3,4. Se han desarrollado numerosos biomateriales como sustitutos óseos, combinando polímeros naturales o sintéticos con materiales mineralizados como el fosfato cálcico o la hidroxiapatit....

Protocolo

Este protocolo utiliza ratones machos desnudos de 4 semanas de edad. Aloje cuatro ratones en una jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 22−24 °C y 50%−70% de humedad relativa. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica y Dental de Tokio (ID de aprobación: A2019-204C, A2020-116A y A2021-121A).

1. Preparación de tampones y reactivos

1. Prepare el medio de crecimiento de células madre mesenquimales (medio de crecimiento MSC) añadiendo el kit de suplemento de medio de crecimiento MSC a....

Discusión

El uso de materiales de andamiaje apropiados que promuevan la transición del cartílago hipertrófico al hueso es un enfoque prometedor para ampliar los injertos de cartílago hipertrófico diseñados basados en MSC y tratar defectos óseos de tamaño clínicamente significativo. Aquí, mostramos que el AH es un excelente material de andamiaje para apoyar la diferenciación del tejido cartilaginoso hipertrófico basado en MSC in vitro y para promover la formación de hueso endocondral in vivo

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332