Aislamiento e identificación de células de nicho limbal

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar e identificar las células del nicho limbal humano.

Resumen

Aquí presentamos un procedimiento estándar para el aislamiento e identificación de células de nicho limbal (LNCs). Para el aislamiento de las LNC se utilizó tejido del limbo obtenido de un banco de ojos. El tejido se dividió en 12 piezas en condiciones asépticas y se digirió durante 18 h a 37 °C en la incubadora de cultivos celulares utilizando colagenasa A para obtener grupos celulares con LNCs y células progenitoras epiteliales limbales. Los grupos celulares se digierieron durante 15 minutos a 37 °C utilizando tripsina-EDTA al 0,25% para obtener células individuales y luego se cultivaron en medio de células madre embrionarias modificadas (MESCM) en una superficie plástica recubierta con Matrigel al 5%. Las células se hicieron pasar tras una confluencia del 70% y los LNC se identificaron mediante inmunofluorescencia, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y citometría de flujo. Los LNC primarios fueron aislados y pasados más de 12 veces. La actividad de proliferación de los LNC de P4 a P6 fue la más alta. Los LNC expresaron marcadores de células madre más altos que los BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR y PDGFRβ). Además, los resultados mostraron que los LNC P4 expresaron uniformemente VIM, CD90, CD105 y PDGFRβ, pero no Pan-CK, lo que podría usarse como marcador para la identificación de LNC. El análisis de citometría de flujo mostró que aproximadamente el 95%, 97%, 92% y 11% de los LNC expresaron CD73, CD90, CD105 y SCF respectivamente, mientras que en las BMMSC fueron del 68%, 99%, 20% y 3%. El proceso estándar para el aislamiento e identificación de LNC podría proporcionar una base de laboratorio confiable para el uso generalizado de LNC.

Introducción

La incidencia de la deficiencia de células madre epiteliales corneales (CESD, por sus siglas en inglés), también llamada deficiencia de células madre limbales (LSCD, por sus siglas en inglés)¹, y la regeneración epitelial corneal (CES, por sus siglas en inglés) son cada vez más urgentes debido a la infección y lesión de la córnea. Si no se trata adecuadamente, el CESD puede provocar ceguera que requiere un trasplante de córnea. Como resultado, la regeneración de CES es cada vez más significativa. Existe un grupo de células de apoyo llamadas células de nicho limbal (LNC, por sus siglas en inglés) que proporcionan un apoyo esencial para la función de CES. Las células madre del estroma limbal fueron aisladas por primera vez por Polisetty et ^al.2 e identificadas por Xie et ^al.3 como LNC que se localizan en el epitelio limbal subyacente y el estroma del limbo. Las LNC son la célula madre de soporte clave del borde corneal y, con la función de las MSC derivadas de la médula ósea (BMMSC), podrían inducirse a desarrollarse en células epiteliales corneales y células estromales corneales, etc.3,4,5,6,7. Estudios previos demostraron que las cualidades de las células madre de las LNC son más primitivas que las^{BMMSCs 8}, que ya se utilizan ampliamente en la clínica. Los LNC pueden incluso convertirse en la próxima opción viable después de MSC, especialmente para el tratamiento de la CESD. Como células de soporte importantes para CES, las LNC también son células madre derivadas de la estructura de "nicho" del limbo. Las LNC pueden desempeñar un papel clave en la desdiferenciación de las células epiteliales corneales maduras (MCEC) a CES⁹. Sin embargo, los estudios sobre los LNC son todavía relativamente insuficientes y no hay consenso sobre la terminología, el aislamiento, la purificación, la identificación y las características de los LNC. Algunos investigadores han nombrado a las LNC células madre estromales derivadas de biopsias limbales 10, células madre mesenquimales limbales 11, células madre de fibroblastos limbales¹² y células estromales mesenquimales limbales¹³. Dado que las características de crecimiento de los LNC no se han descrito en detalle, y debido a sus prometedoras aplicaciones científicas y clínicas, y pueden ser una de las herramientas clínicas más importantes en el futuro, es necesario resumir el aislamiento, la purificación, la identificación y las características de los LNC.

De acuerdo con un estudio previo¹⁴, las LNC están presentes principalmente en el epitelio limbal subyacente y en el estroma del limbo. Este protocolo incluye el tratamiento del tejido del limbo con colagenasa A, la obtención de un grupo formado por LEPC y LNCs, y su digestión en células individuales con tripsina-EDTA (TE) al 0,25%. A continuación, los LNC se cultivaron selectivamente en un medio de células madre embrionarias modificadas (MESCM) para su purificación. El protocolo reportado en este trabajo es simple y tiene una alta eficiencia en la obtención de LNCs humanos en grandes cantidades.

El procedimiento detallado de aislamiento, cultivo e identificación de LNC se grabó en el video para los científicos que están interesados en el estudio de LNC, y se puede repetir convenientemente cuando sea necesario.

Protocolo

El tejido del limbo de donantes de entre 50 y 60 años se obtuvo del Banco de Ojos de la Cruz Roja del Hospital Tongji (Wuhan, China). El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Tongji y se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki.

1. Aislamiento

1. Obtenga tejido del limbo a partir de un medio de almacenamiento corneal a mediano plazo y opere en condiciones asépticas en un banco de trabajo ultralimpio.
2. Raspe y extraiga el iris y el endotelio alrededor de la córnea con una cuchilla redonda quirúrgica estéril.
3. Corte el tejido del limbo en doce trozos del mismo tamaño con una cuchilla quirúrgica con 1 mm a ambos lados de la córnea y la esclerótica.
4. Transfiera los tejidos del limbo a una placa de cultivo de 3,5 cm, agregue 1 mL de colagenasa A (2 mg/mL, en medio DF-12), para sumergir todos los tejidos para la digestión.
5. Coloque la placa en la incubadora celular a 37 °C, digiera los tejidos limbales durante 18 h.
   NOTA: Los procedimientos de seguimiento generalmente se realizan al segundo día.
6. Prepare una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal (Matrigel) al 5%.
   1. Cubrir al 5% la matriz de membrana basal (disuelta en MESCM [Tabla 1]) en el fondo del pozo.
   2. Prepare puntas de 200 μL y 1 mL, un tubo centrífugo de 15 mL y una placa de 6 pocillos en una bolsa esterilizada.
   3. Coloque la bolsa esterilizada (incluidas las puntas y el tubo centrífugo) y una nueva placa de 6 pocillos a un ambiente de -20 °C o -80 °C durante 20 min. Descongelar la matriz de la membrana basal en el refrigerador a 4 °C.
   4. Saque las puntas preenfriadas, el tubo centrífugo y la placa de 6 pocillos del entorno de -20 °C u -80 °C y, a continuación, realice las siguientes operaciones en el banco de trabajo ultralimpio.
   5. Transfiera 50 μL de matriz de membrana basal al 5% a 1 mL de MESCM con una punta de 200 μL y mézclelos suave y uniformemente.
   6. Transfiera la matriz de membrana basal al 5% (disuelta en MESCM) a un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos utilizando la punta preenfriada de 1 mL.
   7. Agite la placa de 6 pocillos suave y horizontalmente, coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en la incubadora celular a 37 °C durante aproximadamente 1 h y luego realice el siguiente paso.
7. Después de 18 h de digestión, saque el tejido limbal digerido por la colagenasa A, solo quedarán algunos pequeños grupos visibles y tejidos esclerales no digeridos.
   NOTA: La microscopía de gran aumento revela un grupo compuesto por muchas células densamente empaquetadas (incluidas las LNC).
8. Utilice una punta de pipeta de 200 μL para separar los grupos de los tejidos esclerales no digeridos bajo el microscopio estereoscópico.
9. Transfiera los racimos a la placa de cultivo de 3,5 cm y sumérjalos en TE al 0,25%, y luego coloque la placa en la incubadora celular durante 15 minutos.
10. Agregue 1 ml de MESCM con suero knockout al 10 % para detener la digestión celular y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender los grupos en células individuales con una punta de pipeta de 1 ml.
11. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml y centrifugue a 200 x g durante 5 min.
12. Retire el sobrenadante con cuidado sin perturbar la precipitación celular y luego agregue 1 ml de MESCM para resuspender las células.
13. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces hasta que la precipitación de la célula inferior se suspenda uniformemente en el MESCM utilizando la punta de pipeta de 1 ml y tomar 20 μl de suspensión celular para el recuento de células.
14. Transfiera la suspensión celular a la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal al 5 % con una punta de pipeta de 1 ml y aumente el volumen de MESCM a 2,5 ml.
15. Agite suavemente la placa de 6 pocillos horizontalmente para distribuir uniformemente las células.
16. Transfiera las células a la incubadora de cultivo después de haber sido fotografiadas y registradas. Observe y fotografíe las células diariamente y cambie el medio cada 3-4 días.

2. Identificación de LNC

1. Tinción por inmunofluorescencia
   1. Digiera los LNC del fondo de la placa con 1 ml de TE al 0,25% durante 5 min en la incubadora de células a 37 °C.
   2. Finalice la digestión añadiendo 1 ml de MESCM (que contiene suero knockout), centrifugue la suspensión celular a 200 x g durante 5 min y aspire el sobrenadante con cuidado.
   3. Agregue 1 ml de MESCM para resuspender las células en suspensión. Prepare una suspensión celular de 80 μL (4 × 10³ celdas por portaobjetos) para 4 portaobjetos (20 μL/portaobjetos) y utilice el sistema de centrífuga para depositar las células en los portaobjetos del microscopio según las instrucciones del fabricante.
   4. Fije las células (adheridas a los portaobjetos en el paso 3) con paraformaldehído al 4% durante unos 10 minutos y, a continuación, permeabilice las células de los portaobjetos con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 15 minutos.
   5. Bloquear las células durante 1 h con albúmina sérica bovina (BSA) al 2% antes de incubarlas con anticuerpos primarios (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) en un agitador durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, eliminar los anticuerpos primarios no unidos lavando (5 min/lavado, 3 veces) los portaobjetos con PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
   6. Incubar los anticuerpos secundarios correspondientes (anticuerpo secundario IgG de burro anti-ratón TRITC [1:1000], IgG anti-conejo burro FITC [1:500], burro anti-ratón IgG 488 [1:300], anti-conejo burro IgG 594 [1:400]) durante 1 h con anticuerpos IgG inespecíficos IgG adecuados. Retire el anticuerpo secundario no unido con PBST (5 min/lavado, 3 veces).
   7. Contratiñir los núcleos con 5 μg/mL de DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol) y sellar los portaobjetos.
   8. Realice imágenes de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia (aumento: 400x; Tiempo de exposición: 50 ms).
2. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)
   1. Tome el kit de aislamiento de ARN para extraer el ARN total según las instrucciones del fabricante.
   2. Utilice un kit de transcripción de ADNc de alta capacidad para realizar la transcripción inversa de 1-2 μg de ARN total a ADNc.
   3. Realice la transcripción inversa (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) y qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 ciclos) en una solución de 20 μL que contenga ADNc (100 ng), mezcla de ensayo de expresión génica TaqMan (1 μL), mezcla maestra de PCR universal (10 μL) y ddH₂O (hasta 20 μL).
   4. Utilizar la técnica de TC comparativa (ΔΔCT)^4,9 para examinar la expresión génica relativa.

3. Caracterización de la LNC

1. Recuento de células (hemocitómetro)
   1. Digiera los LNC desde el fondo de la placa con TE al 0,25% durante 5 min en la incubadora de células a 37 °C.
   2. Finalice la digestión añadiendo 1 ml de MESCM (que contiene suero knockout), centrifugue la suspensión celular a 200 x g durante 5 min y aspire el sobrenadante con cuidado.
   3. Agregue 1 ml de MESCM para resuspender las células, luego tome 10 μl de suspensión celular en un tubo de centrífuga de 0,5 ml. Agregue un volumen igual de solución de tinción de azul de tripano al 0,4%.
   4. Coloque 10 μL de suspensión celular teñida en el área de recuento del hemocitómetro y cúbrala con un cubreobjetos para contar.
      NOTA: El número de celdas en las cinco áreas cuadradas centrales se define como "A"; el número de células en 1 ml se calcula como 5A × 10^{4 ×} 2.
2. Examen de marcadores LNC y BMMSC con citometría de flujo¹⁵
   1. Detectar la expresión de SCF, CD73, CD90 y CD105 en las LNCs y BMMSCs mediante citometría de flujo 15 (2-4 ×^{10 6} eventos/muestra, se obtuvieron 2.000 células de cada una de las muestras, totalizando 550.000 células que fueron activadas simultáneamente).
   2. Recoja y tiña las células a 20-30 °C durante 15 min en un tampón de bloqueo (3% de BSA y 0,05% de Tween-20 en PBS) utilizando anticuerpos premarcados (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] y CD105 [1:50]) según las instrucciones del kit.
   3. Realice análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un citómetro de flujo. En este estudio se utilizaron el software FACS Diva y el software FlowJo. Para cada muestra, registre 10.000 eventos y compuerta y analice células vivas.

Resultados

Crecimiento de LNC
Los LNC se aislaron con éxito de acuerdo con el método de digestión de la colagenasa A (2 mg/mL) del tejido del borde corneoescleral, como se describió anteriormente (Figura 1). De acuerdo con un estudio previamente reportado³, después de la digestión de la colagenasa A, se visualizaron grupos similares a orugas bajo el microscopio (Figura 2). La proporción de células fusiformes aumentó grad...

Discusión

La transparencia de la córnea se mantiene típicamente mediante la disposición y distribución regular de pequeñas fibras (25-30 nm de diámetro) en el estroma corneal, que es crucial para la agudeza visual normal¹⁶. Hay 253 millones de personas con discapacidad visual en todo el mundo, de las cuales 36 millones^{son ciegas}. La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera que la ceguera corneal es uno de los peligros más graves para la vista humana, representando el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	-
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	-
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	-
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	-
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	-
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	-
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	-
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100