Toma de muestras de líquido cefalorraquídeo y sangre de la vena lateral de la cola en ratas durante los registros de EEG

Resumen

El protocolo muestra repetidas recolecciones de líquido cefalorraquídeo y sangre de ratas epilépticas realizadas en paralelo con un monitoreo continuo de video-electroencefalograma (EEG). Estos son fundamentales para explorar posibles vínculos entre los cambios en varias moléculas de fluidos corporales y la actividad convulsiva.

Resumen

Debido a que la composición de los fluidos corporales refleja muchas dinámicas fisiológicas y patológicas, las muestras líquidas biológicas se obtienen comúnmente en muchos contextos experimentales para medir moléculas de interés, como hormonas, factores de crecimiento, proteínas o pequeños ARN no codificantes. Un ejemplo concreto es el muestreo de líquidos biológicos en la investigación de biomarcadores para la epilepsia. En estos estudios, es deseable comparar los niveles de moléculas en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y en el plasma, mediante la extracción de LCR y plasma en paralelo y considerando la distancia temporal de la muestra desde y hacia las convulsiones. La combinación de muestras de LCR y plasma, junto con la monitorización por video-EEG en animales epilépticos, es un enfoque prometedor para la validación de biomarcadores diagnósticos y pronósticos putativos. Aquí, se describe un procedimiento combinado de extracción de LCR de la cisterna magna y la toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola en ratas epilépticas que se monitorean continuamente por video-EEG. Este procedimiento ofrece ventajas significativas sobre otras técnicas comúnmente utilizadas. Permite una toma de muestras rápida con un mínimo de dolor o invasividad, y un tiempo de anestesia reducido. Además, se puede utilizar para obtener muestras de LCR y plasma en ratas ancladas y registradas en EEG por telemetría, y se puede utilizar repetidamente durante varios días de experimento. Al minimizar el estrés debido al muestreo mediante el acortamiento de la anestesia con isoflurano, se espera que las medidas reflejen con mayor precisión los niveles reales de las moléculas investigadas en los biofluidos. Dependiendo de la disponibilidad de un ensayo analítico adecuado, esta técnica se puede utilizar para medir los niveles de múltiples moléculas diferentes mientras se realiza el registro de EEG al mismo tiempo.

Introducción

La toma de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) y sangre son importantes para identificar y validar biomarcadores de epilepsia, tanto en la investigación preclínica como en la clínica ^1,2. Hoy en día, el diagnóstico de la epilepsia y la mayor parte de la investigación sobre biomarcadores de epilepsia se centra en el EEG y la neuroimagen ^3,4,5. Estos enfoques, sin embargo, presentan varias limitaciones. Además de las mediciones rutinarias del cuero cabelludo, en muchos casos, el EEG requiere técnicas invasivas com....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ferrara y por el Ministerio de Salud italiano (autorización: D.M. 603/2022-PR) de acuerdo con las directrices descritas en la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) sobre la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos. Este protocolo se ajusta específicamente para análisis adicionales de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de pequeños ácidos ribonucleicos no codificantes (sncRNA) en el LCR de rata y plasma obtenidos bajo co....

Discusión

El presente trabajo ilustra una técnica fácil de dominar de la recolección de LCR y sangre en ratas, que puede ser útil no solo para estudios en modelos de epilepsia, sino también de otras afecciones o enfermedades neurológicas como el Alzheimer, el Parkinson o la esclerosis múltiple. En la investigación de la epilepsia, ambos procedimientos de muestreo junto con el video-EEG son ideales cuando se busca una correlación entre los niveles de diferentes moléculas solubles y la actividad convulsiva. Por esta razón.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok	BD Italy SpA, Milan, Italy	367246	Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E)	BD Italy SpA, Milan, Italy	365975	Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm	Nipro, Osaka, Japan	PSY-23-ET-ICU	Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R	DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England	112000033	Material
Cotton suture 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA	7343H	Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam	Dechra Veterinary Products, Torino, Italy	105183014 (AIC)	Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	PNM-VIDEO-008	Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up	EZVIZ Network, Hangzhou, Cina	EZVIZ (V5.3.2)	Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity	Laboratoire Garcin-Bactinyl, France	LB 920111	Solution
Dummy guide cannula 8 mm	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	CXD-8	Material
Electrode 3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Electrode holder for stereotxic surgery	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	1776-P1	Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6137	Equipment
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL	Eppendorf Srl, Milan, Italy	30124332	Material
Eppendorf μCuvette G1.0	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6138	Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo	Zoetis, Rome, Italy	103287025 (AIC)	Solution
Ketamine (Imalgene)	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Lithium chloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	L9650	Material
Microinjection cannula 31G 9 mm	Agn Tho's, Lindigö Sweden	CXMI-9	Material
MP150 modular data acquisition and analysis system	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night	Ursapharm, Milan, Italy	941791927 (AIC)	Material
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	P6503	Material
PTFE Tube with joint	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	JT-10	Material
Saline	0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0		Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S2250	Material
Scopolamine methyl nitrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S1876	Material
Silver sulfadiazine 1% cream	Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy	025561010 (AIC)	Material
Simplex rapid dental methacrylic cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA	Model 963	Equipment
Sucrose solution	10% sucrose in distilled water	Home-made	Solution
Syringe 1 mL	Biosigma, Cona, Venezia, Italy	20,71,26,03,00,350	Material
Telemeters	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	CTA-F40	Material
Telemetry EEG traces analyzer	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	NeuroScore v3-0	Equipment
Telemetry system	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	Hardware plus software Ponemah core 6.51	Equipment
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	X1251	Material