Virus pseudotipados como herramienta molecular para monitorizar las respuestas inmunitarias humorales contra el SARS-CoV-2 mediante ensayo de neutralización

Resumen

Los virus pseudotipados (PV) son viriones con replicación defectuosa que se utilizan para estudiar las interacciones huésped-virus en condiciones más seguras que la manipulación de virus auténticos. Aquí se presenta un protocolo detallado que muestra cómo se pueden usar los PV del SARS-CoV-2 para probar la capacidad neutralizante del suero de los pacientes después de la vacunación contra el COVID-19.

Resumen

Los virus pseudotipados (PV) son herramientas moleculares que se pueden utilizar para estudiar las interacciones huésped-virus y para probar la capacidad neutralizante de muestras de suero, además de su uso más conocido en terapia génica para la administración de un gen de interés. Los PV son defectuosos en la replicación porque el genoma viral se divide en diferentes plásmidos que no se incorporan a los PV. Este sistema seguro y versátil permite el uso de fotovoltaicos en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad. Aquí, presentamos una metodología general para producir PVs lentivirales basada en tres plásmidos como se menciona aquí: (1) el plásmido de la columna vertebral que lleva el gen reportero necesario para monitorear la infección; (2) el plásmido de empaquetamiento que transporta los genes de todas las proteínas estructurales necesarias para generar las PV; (3) el plásmido de expresión de glicoproteínas de la superficie de la envoltura que determina el tropismo del virus y media la entrada del virus en la célula huésped. En este trabajo, la espícula del SARS-CoV-2 es la glicoproteína de la envoltura utilizada para la producción de lentivirus pseudotipados no replicativos del SARS-CoV-2.

Brevemente, las células de empaquetamiento (HEK293T) se transfectaron conjuntamente con los tres plásmidos diferentes utilizando métodos estándar. Después de 48 h, el sobrenadante que contenía los PV se recolectó, filtró y almacenó a -80 °C. La infectividad de los PV del SARS-CoV-2 se probó mediante el estudio de la expresión del gen reportero (luciferasa) en una línea celular diana 48 h después de la infección. Cuanto mayor sea el valor de las unidades de luminiscencia relativa (RLU), mayor será la tasa de infección/transducción. Además, los PV infecciosos se añadieron a las muestras de suero diluidas en serie para estudiar el proceso de neutralización de la entrada de los pseudovirus en las células diana, medido como la reducción de la intensidad de RLU: valores más bajos correspondientes a una alta actividad neutralizante.

Introducción

Los virus pseudotipados (PV) son herramientas moleculares utilizadas en microbiología para estudiar las interacciones huésped-virus y patógeno-patógeno 1,2,3,4. Los PV constan de una parte interna, el núcleo viral que protege el genoma viral, y una parte externa, las glicoproteínas de la envoltura en la superficie del virus que define el tropismo⁵. Un pseudovirus es incompetente para la replicación en la célula diana porque no contiene toda la información genética necesaria para generar nuevas partículas virales. Esta....

Protocolo

El presente protocolo ha sido aprobado y sigue las directrices del Comité de Ética de la Universidad de Verona (protocolo de aprobación número 1538). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos humanos que participaron en el estudio. Se recolectaron muestras de sangre entera de trabajadores de la salud voluntarios que estaban en proceso de recibir vacunas contra el SARS-CoV-2. Estas muestras fueron colectadas en tubos de plástico que contenían anticoagulantes para el posterior aislamiento del suero¹⁵.

Todos los procesos siguientes deben realizarse en una campana biológica de Clase 2, trabajando e....

Discusión

A pesar de que el uso de un virus de tipo salvaje simula la infección real, los PV lentivirales son una opción más segura para estudiar los mecanismos asociados con la entrada e infección viral sin los estrictos requisitos de seguridad necesarios para trabajar con virus patógenos ^4,20,21. Los PV están compuestos por un núcleo viral de replicación defectuosa rodeado por la glicoproteína de la envoltura superficial de un .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer - Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100