Microscopía de dos fotones sensible a la polarización para una caracterización estructural amiloide sin marcadores

Resumen

Este artículo describe cómo se podría aplicar la microscopía de dos fotones sensible a la polarización para caracterizar la organización local dentro de las superestructuras de amiloide sin marcado-esferulitas. También describe cómo preparar y medir la muestra, ensamblar la configuración requerida y analizar los datos para obtener información sobre la organización local de las fibrillas amiloides.

Resumen

En comparación con su contraparte de un fotón, la excitación de dos fotones es beneficiosa para los experimentos de bioimagen debido a su menor fototoxicidad, penetración más profunda en los tejidos, operación eficiente en sistemas densamente empaquetados y fotoselección angular reducida de fluoróforos. Por lo tanto, la introducción del análisis de polarización en la microscopía de fluorescencia de dos fotones (2PFM) proporciona una determinación más precisa de la organización molecular en una muestra en comparación con los métodos de imagen estándar basados en procesos ópticos lineales. En este trabajo, nos centramos en el 2PFM sensible a la polarización (ps-2PFM) y su aplicación en la determinación del ordenamiento molecular dentro de bioestructuras complejas-esferulitas amiloides. Las enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer o el Parkinson, a menudo se diagnostican a través de la detección de agregados de proteínas amiloides formados debido a un proceso alterado de plegamiento incorrecto de proteínas. Explorar su estructura conduce a una mejor comprensión de su vía de creación y, en consecuencia, al desarrollo de métodos de diagnóstico más sensibles. En este trabajo se presenta el ps-2PFM adaptado para la determinación del ordenamiento local de las fibrillas dentro de las esferulitas de insulina bovina y agregados proteicos amiloidogénicos esféricos. Además, comprobamos que la técnica propuesta puede resolver la organización tridimensional de las fibrillas dentro de la esferulita.

Introducción

En las últimas décadas, aunque ha habido un desarrollo significativo de numerosas técnicas de microscopía de fluorescencia para la bioimagen de proteínas y sus agregados¹, solo unas pocas se han utilizado para resolver su ordenamiento local dentro de la muestra ^2,3. Se utilizó la microscopía de fluorescencia⁴ para estudiar la heterogeneidad estructural intrínseca de las superestructuras amiloides-esferulitas. Además, la determinación cuantitativa del ordenamiento local dentro de bioestructuras complejas y densamente empaquetadas, como las esferulitas, podría reso....

Protocolo

1. Preparación de los portaobjetos del microscopio con esferulitas adultas

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo. Todas las soluciones se prepararon con agua desionizada (18,2 MΩ·cm a 25 °C) obtenida del sistema de purificación de agua.

1. Incubar las esferulitas amiloides según el protocolo descrito por Krebs et al¹⁶. con algunas modificaciones, como se describe a continuación.
   1. Pesar 10 mg de insulina en polvo en un tubo de 1,5 ml.
   2. Disolver el polvo co....

Discusión

La microscopía de dos fotones sensible a la polarización es una herramienta valiosa para estudiar el orden local de las fibrillas dentro de las superestructuras amiloides, requiriendo solo pequeñas modificaciones de la configuración multifotónica estándar. Dado que opera en fenómenos ópticos no lineales, se puede lograr una fotoselección angular reducida y una resolución axial mejorada en comparación con los métodos de microscopía de fluorescencia excitada por un fotón. Además, conduce a una menor dispersi.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5