Metabolómica dirigida en células primarias raras

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para medir de manera precisa y confiable los metabolitos en tipos de células raras. Las mejoras técnicas, incluido un fluido de vaina modificado para la clasificación de células y la generación de muestras en blanco relevantes, permiten una cuantificación completa de metabolitos con una entrada de solo 5000 células por muestra.

Resumen

La función celular depende críticamente del metabolismo, y la función de las redes metabólicas subyacentes se puede estudiar midiendo los intermedios de moléculas pequeñas. Sin embargo, la obtención de mediciones precisas y fiables del metabolismo celular, especialmente en tipos de células raras como las células madre hematopoyéticas, ha requerido tradicionalmente la agrupación de células de múltiples animales. Un protocolo ahora permite a los investigadores medir metabolitos en tipos de células raras utilizando solo un ratón por muestra, al tiempo que generan múltiples réplicas para tipos de células más abundantes. Esto reduce el número de animales que se requieren para un proyecto determinado. El protocolo presentado aquí implica varias diferencias clave con respecto a los protocolos metabolómicos tradicionales, como el uso de 5 g/L de NaCl como fluido de vaina, la clasificación directa en acetonitrilo y la utilización de una cuantificación dirigida con un uso riguroso de estándares internos, lo que permite mediciones más precisas y completas del metabolismo celular. A pesar del tiempo necesario para el aislamiento de células individuales, la tinción fluorescente y la clasificación, el protocolo puede preservar en gran medida las diferencias entre los tipos de células y los tratamientos farmacológicos.

Introducción

El metabolismo es un proceso biológico esencial que ocurre en todas las células vivas. Los procesos metabólicos implican una vasta red de reacciones bioquímicas que están estrechamente reguladas e interconectadas, lo que permite a las células producir energía y sintetizar^{biomoléculas} esenciales. Para comprender la función de las redes metabólicas, los investigadores miden los niveles de intermediarios de moléculas pequeñas dentro de las células. Estos intermediarios sirven como indicadores importantes de la actividad metabólica y pueden revelar información crítica sobre la función celular.

La espectrometría de masas ....

Protocolo

La cría y la cría de todos los ratones utilizados para este protocolo se llevaron a cabo en una instalación de animales convencionales en el Instituto Max Planck de Inmunobiología y Epigenética (MPI-IE) de acuerdo con las regulaciones de las autoridades locales (Regierungspräsidium Freiburg). Los ratones fueron sacrificados con CO₂ y luxación cervical por personal capacitado en FELASA B siguiendo las directrices y regulaciones aprobadas por el comité de bienestar animal del MPI-IE y las autoridades locales. No se realizó ningún experimento con animales y los ratones no tuvieron problemas de salud.

NOTA: Los métodos analíticos de ....

Discusión

Los pasos más críticos para la implementación exitosa de la metabolómica dirigida utilizando este protocolo son: 1) una estrategia robusta de tinción y compuerta que produzca poblaciones celulares limpias, 2) el manejo preciso de los volúmenes líquidos, 3) el tiempo reproducible de todos los pasos experimentales, en particular todos los pasos previos a la extracción del metabolito. Idealmente, todas las muestras que pertenecen a un experimento deben procesarse y medirse en un lote para minimizar los efectos del l.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C yeast extract	Isotopic Solutions	ISO-1
40 µm cell strainer	Corning	352340
Acetonitrile, LC-MS grade	VWR	83640.32
ACK lysis buffer	Gibco	104921	Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)	Sigma Aldrich	A2754
Adenosine monophosphate (AMP)	Sigma Aldrich	A1752
Adenosine triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade	Fisher Scientific	A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
Heat sealing foil	Neolab	Jul-18
Isoleucine	Sigma Aldrich	58880
JetStream ESI Source	Agilent	G1958B
Leucine	Sigma Aldrich	L8000
Medronic acid	Sigma Aldrich	M9508-1G
Methanol, LC-MS grade	Carl Roth	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer	Agilent	6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC Column Thermostat	Agilent	G7116B
UHPLC Pump	Agilent	G7120A
UHPLC Sample Thermostat	Agilent	G4761A