Imágenes de calcio en retinas planas estimuladas eléctricamente

Resumen

Las prótesis de retina tienen la capacidad de generar percepciones visuales. Para avanzar en el desarrollo de nuevas prótesis, se necesitan métodos ex vivo para probar los dispositivos antes de su implantación. Este artículo proporciona un protocolo completo para estudiar la actividad del calcio en la capa de células ganglionares de la retina cuando se somete a estimulación eléctrica.

Resumen

Las distrofias de retina son una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. Se están realizando grandes esfuerzos para desarrollar prótesis retinianas avanzadas que puedan eludir las células fotorreceptoras sensibles a la luz deterioradas en la retina degenerada, con el objetivo de restaurar parcialmente la visión mediante la inducción de percepciones visuales. Una vía común de investigación consiste en el diseño y la producción de dispositivos implantables con una estructura física flexible, que albergan un gran número de electrodos. Esto permite la generación eficiente y precisa de percepciones visuales. Sin embargo, con cada avance tecnológico, surge la necesidad de un método ex vivo fiable y manejable para verificar la funcionalidad del dispositivo antes de pasar a experimentos in vivo , en los que entran en juego factores que van más allá del rendimiento del dispositivo. Este artículo presenta un protocolo completo para estudiar la actividad del calcio en la capa de células ganglionares de la retina (LCG) después de la estimulación eléctrica. Específicamente, se describen los siguientes pasos: (1) marcar fluorescentemente la retina de la rata utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente, (2) capturar la señal de fluorescencia usando un microscopio de fluorescencia invertida mientras se aplican distintos patrones de estimulación eléctrica, y (3) extraer y analizar los rastros de calcio de las células individuales dentro del GCL. Siguiendo este procedimiento, los investigadores pueden probar de manera eficiente nuevos protocolos de estimulación antes de realizar experimentos in vivo .

Introducción

La retina contiene fotorreceptores, que son células encargadas de detectar la luz. Capturan fotones y los convierten en impulsos nerviosos. Estos impulsos se procesan dentro de la retina y se transmiten a la corteza visual, lo que da lugar a la formación de^{una imagen visual}. La Retinosis Pigmentaria (RP) y la Degeneración Macular Asociada a la Edad (DMAE) son enfermedades degenerativas caracterizadas por la pérdida progresiva de fotorreceptores. Estas retinopatías se encuentran entre las principales causas de ceguera^{en todo} el mundo1, afectan a millones de personas y tienen importantes consecuencias médicas, personales y socioeconómicas para los pacientes, los sistemas sanitarios y la sociedad en su conjunto. Además, con el envejecimiento de la población, se prevé que los casos de DMAE aumenten un 15% para 2050².

En la actualidad, se están llevando a cabo numerosos esfuerzos de investigación para restaurar la visión en pacientes afectados por estas afecciones³. Un abordaje prometedor es el uso de prótesis retinianas, que han demostrado eficacia en la restauración parcial de la visión ^4,5. Estos dispositivos captan la luz de la escena visual y la convierten en pulsos eléctricos. Estos pulsos se administran a través de electrodos dentro de una matriz de microelectrodos (MEA) implantada en el ojo, estimulando las neuronas supervivientes y evitando la función de los fotorreceptores perdidos. Las células ganglionares de la retina activadas (CGR) transmiten la salida al cerebro, donde se interpreta como percepción visual. Sin embargo, las principales limitaciones de los implantes actuales radican en la resolución de la interfase electrodo-tejido⁶ y la estimulación no selectiva de diferentes tipos celulares. Por lo tanto, para optimizar el diseño de nuevos dispositivos implantables para una restauración de la visión más eficiente, es crucial comprender cómo se pueden desarrollar paradigmas de estimulación para activar selectivamente las células en las proximidades de los electrodos.

La imagen de calcio es una técnica ampliamente empleada para estudiar la actividad neuronal, ofreciendo varias ventajas sobre los métodos no ópticos ^7,8. En primer lugar, proporciona resolución celular y subcelular. En segundo lugar, los marcadores de calcio pueden dirigirse a tipos específicos de células. En tercer lugar, permite el seguimiento a largo plazo y, en cuarto lugar, permite la observación de poblaciones celulares enteras al tiempo que distingue entre células activas e inactivas. Este método proporciona evidencia indirecta de la actividad celular con una resolución temporal en el rango de cientos de milisegundos. Los indicadores de calcio fluorescentes codificados genéticamente, como los sensores GCaMP, sufren un cambio conformacional al unirse al calcio, lo que resulta en un aumento de la fluorescencia⁹. Los vectores virales adenoasociados (AAV) recombinantes son un medio eficaz para transducir células de la retina con GCaMP¹⁰.

Este protocolo presenta un método eficiente que utiliza imágenes de calcio para probar los protocolos de estimulación de los implantes de retina. Específicamente, nos enfocamos en el tejido retiniano de rata ex vivo y proporcionamos instrucciones detalladas paso a paso, desde la adquisición de muestras hasta el análisis de datos. Al ofrecer esta guía completa, los investigadores de diversos orígenes pueden embarcarse en la experimentación de estimulación eléctrica con confianza.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices estándar de ética animal (Directiva 86/609/UE de las Comunidades Europeas) y fueron aprobados por los comités locales de ética animal. Para el presente estudio se utilizaron ratas Long Evans de 8 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación de medios y montaje plano

1. Medio de Ames (1 L)
   1. En un frasco de vidrio de 1 L, combine el polvo medio de Ames, 1,9 g/L de NaHCO₃, 10 ml de penicilina/estreptomicina 100x y 1 litro de agua desionizada (consulte la tabla de materiales). Ajustar el pH a 7,4 y la osmolaridad a 280 mOsm con agua desionizada o NaHCO₃. Esterilice la solución filtrándola a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 μm debajo de una campana.
      NOTA: Almacenar el medio esterilizado a 4 °C. Esta solución permanece estable y se puede utilizar hasta por 1 mes.
2. Membranas de montaje
   1. Fije una membrana porosa de PTFE (consulte la Tabla de materiales) a una arandela con pequeñas gotas de pegamento. Deja que se seque durante al menos 15 minutos.
   2. Para lograr la translucidez, sumerja las membranas en etanol al 70% durante 1 min.
   3. Enjuague las membranas dos veces con agua desionizada para eliminar completamente el etanol. Guárdalos en agua desionizada para evitar la opacidad.

2. Etiquetado GCL y montaje plano de retina de rata

NOTA: Este método de marcaje no diferencia las CGR de las células amacrinas desplazadas. Si se desea el marcaje selectivo de las CGR, se debe considerar el uso de AAV con promotores específicos de CGR¹¹ y/o marcaje retrógrado a través del nervio óptico¹². Para discriminar entre clases de CGR ON y OFF-center, clasifique las CGR en función de su respuesta a la luz^13,14 y utilice versiones más recientes de indicadores de calcio codificados genéticamente que ofrecen una mayor sensibilidad y la capacidad de medir potenciales de acción individuales¹⁵.

1. Inyección intravítrea
   1. Anestesiar a la rata Long Evans de 8 semanas de edad con isoflurano al 2%/1%_O2 hasta que no haya reflejo pedale, y mantener la anestesia con una máscara nasal para ratas (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: Durante la anestesia, coloque al animal sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal.
   2. Administre una gota de gotas oftálmicas disponibles en el mercado (ver Tabla de Materiales) para dilatar la pupila.
   3. Antes de proceder con la cirugía, examine el ojo en busca de anomalías mediante fundoscopia y tomografía de coherencia óptica (OCT) con un sistema de imágenes de la retina in vivo . Aplicar una gota de Methocel al 2% para facilitar el contacto córnea-objetivo (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: Si se detecta alguna anomalía, no continúe con los pasos posteriores para ese ojo.
   4. Aplique una gota de Prescaine como anestésico local. Fije el párpado y la conjuntiva limbal con un filamento de sutura disponible en el mercado (consulte la tabla de materiales). Realice una esclerotomía de 1 mm a 4 mm del limbo con una aguja de 30 G.
      1. Coloque una aguja roma de 36 G en una jeringa de precisión e inyecte las partículas AAV que transportan el indicador de calcio codificado genéticamente en el vítreo durante 30 s, en un ángulo de 45°. En este estudio, se utilizó AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 10¹¹ GC/mL en HBSS) (ver Tabla de Materiales).
         NOTA: Las construcciones de AAV que no codifican productos genéticos potencialmente cancerígenos o moléculas de toxinas y que se producen sin un virus auxiliar se pueden manipular en instalaciones de nivel de bioseguridad 1 (BSL-1). De lo contrario, si se considera material biopeligroso bajo la contención de BSL-2, se deben tomar las precauciones adecuadas¹⁶. Los AAV que codifican para GCaMP se consideran BSL-1 y no requieren manipulación en cabinas de bioseguridad.
   5. Aplique una gota de Tobradex (ver Tabla de Materiales) para prevenir la inflamación y como profilaxis antibiótica.
   6. Si lo desea, repita los pasos 2, 3 y 4 con el otro ojo.
      NOTA: Revise a los animales 12-24 h después de la cirugía para asegurarse de que no haya reacciones adversas.
   7. Tres días después de la inyección, examinar la estructura de la retina mediante fundoscopia y OCT con un sistema de imágenes de la retina in vivo (ver Tabla de materiales).
   8. Dos semanas después de la inyección, el GCL debe emitir fluorescencia. Evaluar la estructura de la retina y la expresión de AAV mediante fundoscopia de fluorescencia utilizando un sistema de imágenes de la retina in vivo .
      NOTA: De acuerdo con Weitz et ^al.12, la fluorescencia de AAV2-CAG-GCaMP5G se hace perceptible a la semana siguiente a la inyección y se intensifica a las 2 semanas. A partir de la cuarta semana, la sobreexpresión de GCaMP induce citomorbilidad. Las células moribundas exhiben una alta señal de fluorescencia basal en el núcleo y el citoplasma que no fluctúa en respuesta a la estimulación. En las células sanas, la expresión de GCaMP está confinada al citoplasma y excluida del núcleo 7,8,12,17,18. Estas características pueden observarse ex vivo durante la obtención de imágenes microscópicas. La ventana de expresión génica puede variar según el vector viral y el promotor elegido.
2. Escisión de retina y montaje plano
   NOTA: Dos o tres semanas después de la inyección, las ratas inyectadas intravítreamente son sacrificadas inmediatamente antes de que comience el protocolo de electrofisiología, de acuerdo con las pautas éticas estándar (Directiva 86/609/UE de las Comunidades Europeas) y aprobadas por los comités éticos locales. La inhalación de dióxido de carbono (CO₂) se utiliza como método de eutanasia en este protocolo.
   1. Enucleación ocular
      1. Presione suavemente el exterior de la órbita con un par de pinzas curvas para sobresalir ligeramente el ojo de la cuenca del ojo.
      2. Use un par de tijeras de resorte para cortar los músculos que sostienen el ojo y enuclearlo, teniendo cuidado de no perforar el globo ocular.
         NOTA: A partir de este paso, diseccione la retina bajo un microscopio estereoscópico en medio de Ames oxigenado (95% O₂ / 5% CO₂).
   2. Escisión de retina
      1. Use un par de pinzas curvas pequeñas y unas tijeras de resorte finas para quitar todo el tejido circundante del globo ocular.
      2. Coge un trozo de papel de filtro de aproximadamente 3 cm x 3 cm y colócalo sobre la tapa de un plato de 3,5 cm. Remoja el papel con el medio de Ames.
      3. Coloque el globo ocular encima del papel, con el segmento anterior mirando hacia el operador. Use un par de pinzas rectas para sujetar el globo ocular, colocándolas en la parte superior de la ora serrata en un ángulo de aproximadamente 45° con respecto a la superficie del plato. Haz un pequeño corte con una cuchilla, tomando como referencia el espacio entre las pinzas rectas.
      4. Devuelve el globo ocular al medio de Ames. Use un par de pinzas rectas y unas tijeras de resorte finas para separar los segmentos anterior y posterior del ojo.
      5. Retire con cuidado la lente con dos pares de pinzas rectas. Luego, separa la retina de la esclerótica.
      6. Corte la esclerótica hacia el nervio óptico con unas tijeras de resorte finas hasta que la retina quede aislada de la copa ocular.
      7. Utilice un microscopio estereoscópico de fluorescencia para identificar la región de la retina con la mejor expresión del indicador de calcio.
         NOTA: El grado de propagación viral depende del éxito de la inyección intravítrea. Lograr la fluorescencia en grandes porciones de la retina puede requerir práctica. La experiencia del investigador juega un papel crucial en la obtención de resultados óptimos.
      8. Con una pipeta de plástico de punta cortada, transfiera la pieza seleccionada de la retina a la membrana de montaje (pasos de membranas de montaje). Use un par de pinzas rectas para montar la retina plana con el GCL hacia arriba.
      9. Con una pipeta de plástico unida a una punta de pipeta de 100 μL, retire el medio para permitir que la pieza de retina se adhiera a la membrana porosa. Voltee el conjunto sobre el MEA para que el GCL descanse sobre los electrodos.
      10. Llene el baño de muestra con medio de Ames oxigenado.

3. Obtención de imágenes de calcio ex vivo tras estimulación eléctrica

NOTA: En este trabajo, se utilizó un MEA de prueba de concepto para la experimentación ex vivo . Los MEAs personalizados se fabricaron con electrodos porosos a base de grafeno de 25 μm de diámetro sobre vidrio de borosilicato de 500 μm de espesor con trazas de Ti/Au y posteriormente se aislaron con nitruro de silicio y fotorresistencia SU-8¹². Sin embargo, los métodos de obtención de imágenes de calcio son válidos independientemente del material del electrodo utilizado para la estimulación.

1. Ajuste el sistema de perfusión de modo que el medio de Ames oxigenado perfunda constantemente el baño de muestras a 33 °C con un caudal constante de 5 ml/min.
2. Usando un microscopio de fluorescencia invertida equipado con una lámpara fluorescente, un cubo de filtro FITC y una cámara CMOS, inspeccione la retina en busca de un área donde los electrodos estimulantes y la fluorescencia de las células que expresan GCaMP sean visibles. Para este estudio se utilizó un objetivo de aire 20x NA 0,75.
   NOTA: Para estimular (y registrar) eficazmente las células con los electrodos, la retina y el electrodo deben estar en estrecho contacto. Por lo tanto, las células están visiblemente en el mismo plano focal que los electrodos. Si no es el caso, repita los pasos de la extirpación de la retina a partir del paso 8. Cuando se utilizan retinas de modelos animales sanos (con fotorreceptores en funcionamiento), hay que tener en cuenta que cada vez que se enciende la lámpara fluorescente, se producirán algunas respuestas evocadas generadas por la luz, ya que la retina es sensible a la luz a la longitud de onda utilizada para excitar el sensor GCaMP. Estos cambios de calcio inducidos por la luz se pueden utilizar para evaluar el estado de salud del tejido. Para evitar que la luz se mezcle con respuestas evocadas eléctricamente, encienda la lámpara fluorescente al menos 1 minuto antes de iniciar la adquisición de imágenes.
3. Para obtener respuestas evocadas eléctricamente en el GCL, seleccione un electrodo para enviar pulsos controlados por corriente. Configure los parámetros de estimulación eléctrica en el software del dispositivo generador de pulsos, tales como: forma, amplitud, duración, retardo de fase y frecuencia de los pulsos que se aplicarán.
   NOTA: Los parámetros de estímulo efectivos pueden variar ampliamente desde anchos de pulso de 50 μs a 100 ms, con amplitudes que van desde 0,1 μA a 10 μA. Estos parámetros, junto con la frecuencia del estímulo, la polaridad del estímulo, el número de pulsos y los retrasos entre fases, pueden influir en la respuesta espaciotemporal observada por las imágenes de calcio 19,20,21,22. Un tren de 40 pulsos bifásicos que administran una estimulación de 1 ms y 2 μA a menudo genera una respuesta visible en las neuronas marcadas.
4. Para sincronizar la adquisición de imágenes con la administración de estimulación, utilice el generador de pulsos como disparador externo para controlar el inicio de la adquisición de imágenes. Conecte la cámara (consulte la Tabla de materiales) con el generador de impulsos utilizando la señal de disparo de salida y ajuste el "Modo de captura" del software de la cámara en "Disparador de inicio externo". Presione Inicio en el software de la cámara para que espere un disparador externo para comenzar. Inicie la adquisición de imágenes con el software generador de pulsos.
   NOTA: Es posible que el control de disparo externo esté configurado de forma diferente para diferentes cámaras. Este estudio normalmente adquirió imágenes (512 x 512 píxeles, escala de grises de 16 bits) a 10 fotogramas por segundo durante 1 minuto, al tiempo que proporcionaba ráfagas de trenes de pulsos bifásicos cada 10 segundos. La entrega de pulsos comienza después de 10 s, por lo que los primeros fotogramas en todos los experimentos corresponden a la actividad espontánea. Dependiendo del sensor GCaMP y del análisis que se vaya a realizar, es posible que sea necesario ajustar la velocidad de grabación de acuerdo con los tiempos de subida y bajada de su indicador de calcio⁸. Considere la sensibilidad para detectar potenciales de acción individuales del indicador de calcio¹⁵.
5. Guarde las imágenes con un nombre de archivo que incluya los parámetros de estimulación eléctrica aplicados, como [Número de electrodo]_[Amplitud de impulso]_[Duración del impulso]_[Frecuencia de impulso]_Image001.

4. Análisis de datos

1. ImageJ/FIJI para extraer el perfil de intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo y las coordenadas espaciales de los somas celulares
   1. Segmente la región de interés (ROI) con las "Herramientas de selección de área" y agréguela al Administrador de ROI (Herramientas de análisis > > Administrador de ROI > Agregar). En el menú Administrador de ROI, guárdelo como una carpeta .zip (Más > Guardar).
      NOTA: Normalmente, se pueden aplicar los mismos ROI a todos los experimentos de estimulación, ya que corresponden al mismo campo de visión.
   2. Seleccione el "Valor medio de gris" como parámetro a extraer (Analizar > Establecer mediciones).
   3. Extraiga el "Valor medio de gris" de los somas de la celda haciendo clic en Más > Multi Measure. Aparecerá un cuadro de diálogo. Habilite las opciones Medir los 600 sectores y Una fila por sector para obtener una sola tabla en la que las columnas correspondan a los ROI y las filas correspondan a los períodos de tiempo. Guarde la tabla generada como una hoja de cálculo .xls.
   4. Seleccione el "Centroide" como parámetro a extraer (Analizar > Establecer medidas).
   5. Extraiga el "Centroide" de los ROI haciendo clic en Medir. La tabla generada corresponde a las coordenadas (X,Y) de los ROIs. Guárdalo como una hoja de cálculo .xls.
2. Script personalizado para identificar las células que responden a los estímulos
   NOTA: Aquí se utilizó MATLAB (consulte la Tabla de materiales), pero los pasos descritos se pueden realizar en cualquier lenguaje de programación. Los usuarios pueden obtener nuestro script personalizado solicitando el autor correspondiente.
   1. Corrección del efecto de fotoblanqueo: Para mitigar el efecto de fondo y fotoblanqueo, tome de 15 a 20 fotogramas de los períodos no estimulantes antes de cada ráfaga y ajústelos a una curva lineal [ajuste (poly1)].
      NOTA: En este caso, para una película total de 600 fotogramas en la que se enviaron ráfagas periódicas de trenes de impulsos cada 10 s, los fotogramas 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 se consideraron períodos no estimulantes.
   2. Normalizar usando la fórmula: (X-min) / (max-min)
   3. Identificación de las células que responden
      1. Calcule la raíz cuadrática media (RMS) de los períodos no estimulantes a partir de los datos normalizados. Esto se considerará como la señal de referencia.
      2. Calcule el máximo de los períodos estimulantes (marcos entre los períodos no estimulantes). En este caso, para una película total de 600 fotogramas en la que se enviaron ráfagas periódicas de trenes de pulsos cada 10 s, los fotogramas 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569 se consideraron como los períodos de estimulación.
      3. Si el valor máximo supera la señal de referencia en 2,5 veces para un ROI específico, etiquete la celda como respondiendo a ese período de estimulación. Si la célula responde a tres de los cinco períodos de estimulación, clasifíquela como una célula que responde.

Discusión

El protocolo aquí descrito sirve para estudiar la dinámica del calcio que se produce en el LCG de la retina de la rata tras la estimulación eléctrica proporcionada con un MEA. Es un método fiable y manejable, pero requiere algo de entrenamiento, sobre todo para etiquetar uniformemente el LCG de forma eficiente y para montar la retina correctamente para garantizar un contacto óptimo entre el tejido y el electrodo. Este protocolo es específico para roedores y debe adaptarse si se aplica a una especie de laboratorio diferente. Se presentan en detalle los puntos críticos, modificaciones y limitaciones de la metodología.

Inyecciones intravítreas
Las inyecciones se utilizan ampliamente para la administración de genes oculares, siendo las inyecciones intravítreas el procedimiento preferido. Se ha demostrado que son más seguras y menos invasivas en comparación con las inyecciones subretinianas, que introducen las moléculas de interés directamente entre los fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina (EPR), con riesgo de desprendimiento de retina¹⁰. Sin embargo, existen limitaciones, especialmente cuando se realizan estas inyecciones en modelos de roedores. El humor vítreo es gelatinoso, lo que dificulta la difusión viral. Además, el cristalino de los ojos de los roedores es grande, por lo que no es trivial insertar la aguja sin rayarla. Las agujas de jeringa de precisión son delicadas y deben reemplazarse con frecuencia. Para evitar obstrucciones, lávelos con agua desionizada antes y después de cada uso y reemplácelos regularmente. Además, inyecte el contenido lentamente para evitar el reflujo de la solución y los cambios en la presión intraocular. Lograr una fluorescencia grande y uniforme a través de la retina puede requerir práctica.

Transducción de células retinianas
Los vectores virales son un método excelente para la administración de genes in vivo, y los AAV se han utilizado ampliamente para la transducción de células de la retina¹⁰. Han sido aprobados como tratamiento para algunas retinopatías causantes de ceguera humana²⁴. Sin embargo, su capacidad de portador está limitada a 5 kb, incluyendo los elementos regulatorios requeridos (por ejemplo, el promotor)^10,25. Hay múltiples serotipos disponibles, cada uno con un tropismo diferente. Elegir el AAV más adecuado en función de los genes que se van a entregar y de las células que se van a transducir²⁶. Para el etiquetado de los RGC, se recomienda utilizar AAV2²⁷.

Ventana de expresión génica
La expresión viral óptima para AAV2-CAG-GCaMP5G es de 2 a 3 semanas después de la inyección ^12,18. Más allá de ese período de tiempo, los núcleos de las células transfectadas se vuelven fluorescentes, las células dejan de responder a los estímulos y, finalmente, mueren ^7,28,29. Esto se debe a la sobreexpresión del indicador GCaMP, que se transloca al núcleo. La ventana de tiempo para la expresión génica óptima variará según el vector viral y el promotor elegido³⁰ y debe determinarse experimentalmente antes de continuar con este protocolo.

Contacto tejido-electrodo
Para obtener resultados óptimos y reproducibles, es crucial lograr un buen contacto tejido-electrodo. La falta de contacto suele deberse a la curvatura natural de la retina. Un enfoque consiste en cortar la retina en cuartos, montarla y obtener imágenes de una sección a la vez. Las pequeñas porciones de la retina se pueden aplanar mejor, lo que resulta en un contacto más efectivo con la superficie de la MEA. Otra posible razón para el mal contacto es la presencia de humor vítreo. Al realizar experimentos de estimulación simulando un implante epirretiniano, es importante eliminar cuidadosamente el humor vítreo durante la escisión de la retina, ya que puede actuar como aislante de la corriente. Aquí, se describe un método simple para verificar si el contacto es suficiente visualizando el electrodo y las celdas en el mismo plano focal.

Una alternativa a las mediciones retinianas ex vivo es cultivar neuronas directamente en la superficie de los electrodos. El cultivo primario de neuronas, como las neuronas del hipocampo³¹, puede ser útil para las pruebas iniciales para evaluar la funcionalidad del nuevo dispositivo estimulante. Sin embargo, este enfoque todavía requiere el uso de animales de laboratorio y no representa la complejidad de la red retiniana, que es importante para evaluar las respuestas sinápticas a la estimulación.

Para visualizar las celdas debajo del electrodo y las trazas de electrodos, se pueden utilizar MEA fabricados con materiales transparentes como el óxido de indio y estaño (ITO) 19,20,32. Además de las mediciones ópticas, la actividad de GCL tras la estimulación eléctrica se puede evaluar a través de registros eléctricos. El MEA se puede utilizar para registrar el potencial de campo local (LFP) del tejido. Sin embargo, esto compromete la resolución espacial, ya que cada electrodo captura la actividad de varias celdas simultáneamente (dependiendo de las dimensiones del electrodo). La grabación óptica supera esta limitación y ofrece un mapeo de mayor resolución espacial. Su principal ventaja es la capacidad de distinguir entre células activas e inactivas mientras se mide un gran campo de visión con resolución de una sola célula. Entre todos los indicadores de actividad celular, los indicadores de calcio están bien descritos y son los más utilizados³³.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x NA 0.75 S Fluor air objective	Nikon	CFI Super Fluor 20X	-
3.5 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-90	-
30 G needle	VWR	613-5373	-
36 G blunt needle	World Precision Instruments	NF36BL-2	-
6 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-94	-
AAV2-CAG-GCaMP5G	Vector Biolabs	-	-
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420	-
Blade	Swann-morton	0308	-
Camera	Hamamatsu	ORCA Flash v4.0	-
Carbogen	Air liquide	-	-
Curved-forceps	-	-	-
Fine spring-scissors	FST	91501-09	-
FITC filter cube	Nikon	Standard series	-
Fluorescent lamp	Nikon	C-HGFI	-
Fluorescent stereomicroscope	Nikon	SMZ25	-
HBSS	Capricorn	HBSS-1A	-
ImageJ/FIJI	NIH	v1.50i	-
In vivo retinal imaging system	Phoenix Research Laboratories	Micron III	-
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti	-
Isofluorane	Arrane Baxter Laboratories	-	-
Long-Evans rat	Janvier	-	-
MATLAB (Version R2021b)	Mathworks	-	-
Media filters	Merckmillipore	SCGPS02RE	-
Methocel 2%	Omni Vision	-	-
Microelectrode array (MEA)	-	Custom-made
NaHCO3	Thermofisher	42427	-
Penicillin/Streptomycin 100x	Thermofisher	15140122	-
Phenylephrine	Alcon Cusí Laboratories	653437.3	100 mg/mL
Plastic pipette	VWR	612-1793	-
Porous membrane	Merckmillipore	#JVWP01300	-
Precision syringe	World Precision Instruments	10 µl Nanofil	-
Prescaina	Llorens	-	Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic
Rat nasal mask	Xenotec	XRK-RA	-
Small curved-forceps	Bbraun	AESCBD311R	-
Spring-scissors	FST	15040-11	-
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000	-
Straight forceps	FST	11252-20	-
Suture filament	Vitrex Medical	4328	Nilon monofilament, 7/0, DS12
Tobradex	Alcon Cusí Laboratories	-	Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL)
Tropicamide	Alcon Cusí Laboratories	653486	10 mg/mL
Washer	Thorlabs	W8S038	-