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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para injertar organoides cerebrales humanos en múltiples etapas de maduración en la membrana corioalantoidea (CAM) del pollo. Los organoides cerebrales se cultivaron siguiendo protocolos estandarizados no guiados.

Resumen

El injerto de organoides en tejidos vascularizados en animales modelo, como la membrana corioalantoidea (CAM) inmunodeficiente de ratones o embriones de pollo, ha demostrado ser eficaz para el modelado de la neovascularización. La MCA es una membrana extraembrionaria ricamente vascularizada, que muestra una inmunorreactividad limitada, convirtiéndose así en un excelente modelo de hospedaje para trasplantes de células de origen humano.

En este trabajo se describe la estrategia para injertar organoides cerebrales humanos diferenciados en múltiples etapas de maduración en la CAM. La composición celular de los organoides cerebrales cambia con el tiempo, reflejando los hitos del desarrollo del cerebro humano. Injertamos organoides cerebrales en etapas de maduración relevantes: expansión neuroepitelial (18 DIV), neurogénesis temprana (60 DIV) y gliogénesis temprana (180 DIV) en la MCA de embriones embrionarios de pollo del día (E)7. Los organoides cerebrales injertados se recolectaron 5 días después y se analizaron sus características histológicas.

No se detectaron signos histológicos de neovascularización en los organoides injertados ni vasos sanguíneos anormales adyacentes a los injertos. Además, se observaron cambios notables en la composición celular de los organoides injertados, a saber, un aumento en el número de astrocitos gliales fibrilares ácidos positivos reactivos a proteínas. Sin embargo, los cambios citoarquitectónicos dependieron de la etapa de maduración de los organoides. En conjunto, estos resultados sugieren que los organoides cerebrales pueden crecer en la MCA y muestran diferencias en la citoarquitectura dependiendo de su etapa de maduración en el momento del injerto.

Introducción

Los organoides cerebrales humanos son una técnica emergente que permite recapitular in vitro el desarrollo temprano del cerebro humano 1,2,3. Sin embargo, una de las principales limitaciones de este modelo es la falta de vascularización, que desempeña un papel indispensable no solo en la homeostasis cerebral, sino también en el desarrollo cerebral4. Además del suministro de oxígeno y nutrientes, la evidencia acumulada sugiere que el sistema vascular del cerebro regula la diferenciación neuronal, la migración y la sinaptogénesis durante el desarrollo 5,6. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer modelos confiables que puedan proporcionar la señalización vascular y la estructura faltantes a los organoides cerebrales, lo que aumenta la complejidad de la generación de organoides cerebrales humanos7.

Entre los métodos propuestos para la vascularización, se pueden considerar dos líneas principales: el injerto de organoides en un organismo vivo y las tecnologías puramente in vitro que cocultivan células endoteliales y células neurales 8,9,10,11,12. El trasplante intracerebral en ratones es costoso y requiere mucho tiempo, lo que hace que otras tecnologías sean relevantes para modelos más simples. El ensayo de membrana corioalantoidea de pollitos (CAM) se ha utilizado ampliamente para estudiar la angiogénesis 13,14,15. En la última década, varios grupos han injertado con éxito diferentes tipos de organoides, incluidos el riñón16,17, el cardíaco18 y los organoides tumorales19,20, en CAM. Sin embargo, se sabe poco sobre la eficacia, la toxicidad/rechazo, el efecto fisiológico y los métodos para injertar organoides cerebrales humanos en la MCA. Otro aspecto interesante y aún inexplorado es la formación de una barrera hematoencefálica quimérica (BHE) entre la MCA y la interfase astrocítica organoide. Trabajos pioneros previos sugirieron la viabilidad putativa de generar una BHE en la MCA mediante el trasplante de astrocitos y medio condicionado por astrocitos 21,22,23. Sin embargo, los astrocitos maduros parecen ser incapaces de lograrlo24,25. Por lo tanto, la formación de la BHE inducida por astrocitos sigue siendo discutible, y el trasplante de organoides cerebrales humanos nos permitiría arrojar luz sobre esta controversia.

Este artículo de video describe un protocolo para un trasplante in ovo de organoides cerebrales humanos en MCA que promueve el crecimiento, la mejora y la vascularización, lo que da como resultado organoides que abarcan elementos de BHE histológicamente compatibles. Aquí, presentamos un protocolo que garantiza la supervivencia del embrión de pollo e informamos sobre la permisividad de la MCA para mantener el crecimiento de organoides cerebrales.

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Protocolo

Los embriones de pollo Leghorn blanco (Gallus gallus) fueron tratados siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Recursos para Animales de Laboratorio, Comisión de Ciencias de la Vida, Consejo Nacional de Investigación, EE.UU., y los experimentos fueron aprobados por el Consejo para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación de la Universidad de Barcelona.

1. Preparación no guiada de organoides cerebrales

  1. Mantener células madre embrionarias humanas (hESCs) H9 en mTESR1 precalentadas a temperatura ambiente (RT) bajo una confluencia del 70% en placas de 6 pocillos recubiertas con Matrigel disueltas en DMEM (1:40) en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C.
    NOTA: Matrigel debe mantenerse en hielo hasta su uso como recubrimiento para evitar su polimerización.
  2. Generar organoides cerebrales siguiendo el protocolo cerebral no guiado 2.
    1. Disociar las hESCs H9 utilizando 500 μL de la solución de disociación celular e incubar durante 3-5 min a 37 °C. Resuspender en mTESR1 que contiene un inhibidor de ROCK Y27632 (concentración final 50 μM) y sembrar 9.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos pretratada de baja adherencia.
    2. Una vez que los organoides se agregan en mTESR1 que contiene un inhibidor de ROCK Y27632 (concentración final de 50 μM), transfiéralos a un medio de inducción durante 5-6 días.
    3. Siguiendo el protocolo de organoides cerebrales no guiados26, transfiera los organoides a los medios de inducción neural a los ~ días 4-5.
    4. Una vez que adquieran el tamaño y el anillo de neuroepitelio, transfiéralos a una gota de Matrigel helada. Una vez polimerizado el Matrigel, transfiera los organoides a una placa de Petri de baja adherencia de 5 cm con 5 mL de medio de maduración precalentado.
    5. Después de 4 días, ponga los organoides cerebrales bajo agitación orbital.
  3. Recoja los organoides para cosecharlos en DPBS frescos inmediatamente antes del injerto.

2. Mantenimiento del huevo, activación del desarrollo y punción de la cáscara del huevo

  1. Almacenar los óvulos fecundados (en el día 0) en una incubadora a 18 °C hasta su uso.
    NOTA: A esta temperatura, no se desarrollan, permaneciendo en la misma etapa de maduración.
  2. Cuando sea necesario para su uso, incubarlos a 38 °C y 60% de humedad relativa con una rotación de balanceo suave en un ángulo de 45 °C.
  3. El día 1, limpie la superficie de la cáscara de huevo con etanol al 70% y séquela con una toalla de papel para esterilizarla.
  4. Coloque un vendaje adhesivo de papel quirúrgico, en lo sucesivo denominado "vendaje", encima del huevo, cubriendo la cámara de aire del huevo.
    NOTA: Esto evitará que el polvo de la cáscara de huevo caiga en el CAM donde se atasca.
  5. Realice la punción de perforación de la cámara de aire, en lo sucesivo denominada orificio de la cámara de aire (ACH), con una aguja estéril de 21 G x 11/2 '', perforando suavemente la cáscara del huevo. Abra el ACH en la punta superior del huevo para evitar perturbar el CAM, que en este punto se encuentra separado de la cáscara.
  6. Para encontrar la mejor posición para perforar el ACH, use una lámpara para determinar la superficie más delgada de la cáscara del huevo en la punta superior del huevo. La transmisión directa del haz de luz indica la mejor posición para perforar.
  7. Cubra la ACH con un vendaje nuevo para proteger el embrión del ambiente externo y vuelva a colocar el huevo en la incubadora.
  8. A partir de este momento, cesa la rotación en la incubadora y mantén los huevos en posición vertical con la ventana en la parte superior.
    NOTA: Esto facilitará el desarrollo del embrión, y la MCA estará disponible en la parte superior con una cámara de aire entre el embrión y la cáscara del huevo, lo que permitirá el injerto posterior.
  9. Abra el ACH desde el día 1 hasta el día 4. La viabilidad aumenta el día 4 (3 días antes del día del injerto).

3. Injerto de organoide cerebral

  1. Realizar el injerto en el día 7 cuando la MCA esté bien desarrollada y vascularizada, cubriendo el óvulo por todo el embrión.
  2. Retire el vendaje y limpie la superficie de la cáscara de huevo con etanol al 70% para esterilizar la cáscara de huevo, antes de ensanchar cuidadosamente la ACH en una ventana de injerto.
  3. Coloque un vendaje nuevo y más grande que cubra la extensión más allá de la ventana de injerto final para evitar que los fragmentos de cáscara de huevo caigan en la CAM mientras se agranda la ventana de injerto.
    NOTA: Esta ventana más grande es necesaria para seleccionar la mejor posición de injerto y para el injerto posterior.
  4. Amplíe la ventana de injerto perforando suavemente la cáscara del huevo hasta que la ventana alcance un diámetro de aproximadamente 2 cm. Retire suavemente los bordes de la ventana de cáscara de huevo con unas pinzas hasta que la ventana se agrande. Retire el polvo restante y los trozos de cáscara de huevo que permanecerán adheridos al vendaje despegando suavemente el vendaje.
  5. Coloque el organoide con una pipeta automática P200. Corte las puntas con tijeras estériles y afiladas para agrandar la abertura de acuerdo con el tamaño del organoide y evitar daños al organoide o use puntas estériles de transferencia de calibre ancho. Recoger el organoide en un volumen máximo de 50 μL de PBS y transferirlo directamente al CAM, en un lado opuesto a la ubicación del embrión.
  6. Asegúrese de que la posición del injerto esté alejada de la yema para evitar su ruptura durante la recolección y, preferiblemente, colóquelo cerca de un vaso sanguíneo.
  7. Coloque una gota de 7 μL de Matrigel alrededor del organoide después de colocar el organoide en el CAM.
    NOTA: Esto evitará que el organoide se mueva alrededor de la membrana.
  8. Cierre la ventana con un pequeño trozo de parafilm que se ajuste al tamaño exacto de la ventana y fíjelo a la carcasa con un vendaje adhesivo.
    NOTA: Es importante cubrir completamente la ventana con el parafilm para evitar que el embrión se seque y permitir el intercambio de gases. Delimitar adecuadamente la extensión de la cobertura de la ventana, evitando exceder la ventana, ya que podría dificultar el intercambio gaseoso necesario para el correcto desarrollo embrionario27.

4. Recolección de organoides trasplantados

  1. Cosechar los organoides injertados y la CAM circundante en el día 12 de desarrollo de los pollos, correspondiente a la etapa de desarrollo de 38 Hamburguesas y Hamilton (HH38)28, 5 días después del injerto. En esta etapa, la MCA está completamente diferenciada con la vasculatura madura, mientras que los gérmenes de las plumas cubren las alas y el párpado superior del embrión.
  2. Al retirar el vendaje adhesivo, amplíe aún más la ventana para facilitar la recolección de muestras con tijeras y pinzas finas.
  3. Visualice el organoide con la ayuda de una microscopía de disección binocular si es necesario, seguido de un paso de prefijación de 2 minutos con paraformaldehído (PFA) al 4% para ayudar a la recolección del organoide y CAM.
  4. Recoja una sección de1,5 cm 2 del CAM que contenga el organoide.
  5. Fijación de la muestra
    1. Lavar las muestras con 1x PBS y fijarlas con PFA al 4% (en PBS, pH 7,2) durante 30 min a 4 °C. A continuación, lave las muestras durante 3 x 5 min en PBS.
    2. Almacenar las muestras a 4 °C en PBS con azida sódica o crioprotegerlas directamente en sacarosa-PBS al 30% durante la noche a 4 °C.
    3. Tras la crioprotección, incruste las muestras en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y guárdelas a -20 °C hasta el corte. Cortar rodajas de tejido de 20 μm de grosor con un criostato y recogerlas en portaobjetos xilanizados. Guarde los portaobjetos a -20 °C hasta que se utilicen para teñir.

5. Inmunofluorescencia

  1. Retire la OCT de las secciones con una solución de PBS con Triton X-100 (PBS-T) al 0,1% durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
  2. Tratar las secciones con una solución de bloqueo (BS) con una solución de PBS-T al 0,01% de suero de burro al 2% y al 3% durante 1 h en RT.
  3. Diluir el anticuerpo primario seleccionado (ver la Tabla de Materiales) en BS e incubar las muestras durante la noche a 4 °C.
  4. Al día siguiente, lave las muestras 3 x 10 min en 1x PBS en RT.
  5. Diluir el anticuerpo secundario en BS e incubar durante 2 h a RT (ver Tabla de Materiales).
  6. Incubar las muestras durante 10 min con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar los núcleos celulares en RT, diluido en PBS-T a una dilución de 1:1.000.
  7. Monte las guías con un medio de montaje y cúbralas con cubreobjetos de vidrio.
  8. Tome todas las imágenes con un microscopio de fluorescencia de campo amplio a 2,5, 10, 20 y 40x.
  9. Conservar las lonchas a 4 °C.

6. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

NOTA: Para comprobar que el injerto funcionó, realice la tinción H&E.

  1. Eliminar OCT con PBS-T 0.1% durante 10 min en RT.
  2. Realice la deshidratación en serie en una campana de la siguiente manera: 10 min en agua destilada (DW), 45 s en hematoxilina, 1 min en DW, 20 s en PBS, 2 x 30 s en EtOH al 70%, 2 x 30 s en EtOH al 80%, 2 x 30 s en EtOH al 96%, 30 s en eosina, 2 x 15 s en EtOH al 96%, 2 x 15 s en 100% EtOH, 1 min en xilol-100% ETOH, 1 min en xilol, 1 min en xilol (fresco).
  3. Monte los cubreobjetos de vidrio con un medio de montaje a base de xileno.

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Resultados

Selección del programa de maduración embrionaria para el trasplante
El experimento comienza en D0 cuando los huevos fertilizados se incuban a 38 °C y 60% de humedad relativa. La membrana corioalantoidea (MCA) es una membrana extraembrionaria altamente vascularizada que se desarrolla después de la incubación de los huevos. Está formado por la fusión de los alantoides y el corion. En D1, después de 24 h de incubación, la cámara de aire se perfora para evitar que el CAM se adhiera a la membrana...

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Discusión

En este estudio, describimos un protocolo detallado con numerosos pasos clave que proporcionan un crecimiento y desarrollo favorable de los organoides del cerebro humano tras el injerto sin perturbar la supervivencia de los embriones de pollo. Se recomendó el uso de agujas estériles para perforar la cámara de aire del huevo después de 24 h de incubación (día 1). Además, también intentamos hacer la punción en el día 4 (después de revisar la cáscara del huevo con luz para probar el desarrollo de la vasculatura ...

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Divulgaciones

Los autores no reportan ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Alcántara y al Dr. Ortega de la UB y al resto de los miembros del laboratorio del Dr. Acosta por las esclarecedoras discusiones. S.A. es profesor ayudante doctor de la Generalitat de Catalunya en la Universitat de Barcelona.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse BioLegend8012011:1,000
Anti-GFAP, rabbitGeneTexGTX1087111:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.InvitrogenA-212061:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goatJackson ImmunoResearch715-585-1501:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggsGranja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPIInvitrogenD13061:10,000
DPXSigma100579xylene-based mounting medium 
Gentle Dissociation SolutionCreativeBiolabsITS-0622-YT187cell dissociation solution
MatrigelBD Biosciences356234
Mowiol 4-88 mounting mediaMerk81381
Paper towel, lab-gradeSigma-AldrichZ188956
ROCK inhibitor Y27632MilliporeSCM07510 nM
Sharp-Point Surgical ScissorsVWR470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope SlidesEprediaJ1800AMNZ

Referencias

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