Modelado de nicho neurovascular de organoides cerebrales humanos tempranos no guiados en la membrana corioalantoidea permisiva del embrión de pollo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para injertar organoides cerebrales humanos en múltiples etapas de maduración en la membrana corioalantoidea (CAM) del pollo. Los organoides cerebrales se cultivaron siguiendo protocolos estandarizados no guiados.

Resumen

El injerto de organoides en tejidos vascularizados en animales modelo, como la membrana corioalantoidea (CAM) inmunodeficiente de ratones o embriones de pollo, ha demostrado ser eficaz para el modelado de la neovascularización. La MCA es una membrana extraembrionaria ricamente vascularizada, que muestra una inmunorreactividad limitada, convirtiéndose así en un excelente modelo de hospedaje para trasplantes de células de origen humano.

En este trabajo se describe la estrategia para injertar organoides cerebrales humanos diferenciados en múltiples etapas de maduración en la CAM. La composición celular de los organoides cerebrales cambia con el tiempo, reflejando los hitos del desarrollo del cerebro humano. Injertamos organoides cerebrales en etapas de maduración relevantes: expansión neuroepitelial (18 DIV), neurogénesis temprana (60 DIV) y gliogénesis temprana (180 DIV) en la MCA de embriones embrionarios de pollo del día (E)7. Los organoides cerebrales injertados se recolectaron 5 días después y se analizaron sus características histológicas.

No se detectaron signos histológicos de neovascularización en los organoides injertados ni vasos sanguíneos anormales adyacentes a los injertos. Además, se observaron cambios notables en la composición celular de los organoides injertados, a saber, un aumento en el número de astrocitos gliales fibrilares ácidos positivos reactivos a proteínas. Sin embargo, los cambios citoarquitectónicos dependieron de la etapa de maduración de los organoides. En conjunto, estos resultados sugieren que los organoides cerebrales pueden crecer en la MCA y muestran diferencias en la citoarquitectura dependiendo de su etapa de maduración en el momento del injerto.

Introducción

Los organoides cerebrales humanos son una técnica emergente que permite recapitular in vitro el desarrollo temprano del cerebro humano ^1,2,3. Sin embargo, una de las principales limitaciones de este modelo es la falta de vascularización, que desempeña un papel indispensable no solo en la homeostasis cerebral, sino también en el desarrollo cerebral⁴. Además del suministro de oxígeno y nutrientes, la evidencia acumulada sugiere que el sistema vascular del cerebro regula la diferenciación neuronal, la migración y la sinaptogénesis durante el desa....

Protocolo

Los embriones de pollo Leghorn blanco (Gallus gallus) fueron tratados siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Recursos para Animales de Laboratorio, Comisión de Ciencias de la Vida, Consejo Nacional de Investigación, EE.UU., y los experimentos fueron aprobados por el Consejo para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación de la Universidad de Barcelona.

1. Preparación no guiada de organoides cerebrales

1. Mantener células madre embrionarias humanas (hESCs) H9 en mTESR1 precalentadas a temperatura ambiente (RT) bajo una confluencia del 70% en placas de 6 pocill....

Discusión

En este estudio, describimos un protocolo detallado con numerosos pasos clave que proporcionan un crecimiento y desarrollo favorable de los organoides del cerebro humano tras el injerto sin perturbar la supervivencia de los embriones de pollo. Se recomendó el uso de agujas estériles para perforar la cámara de aire del huevo después de 24 h de incubación (día 1). Además, también intentamos hacer la punción en el día 4 (después de revisar la cáscara del huevo con luz para probar el desarrollo de la vasculatura .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ