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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Drosophila es un modelo bien establecido para estudiar moléculas clave que regulan la miogénesis. Sin embargo, los métodos actuales son insuficientes para determinar la dinámica transcripcional del ARNm y la distribución espacial dentro de los sincitios. Para abordar esta limitación, optimizamos un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN que permite la detección y cuantificación de ARNm a escala de una sola molécula.

Resumen

Los músculos esqueléticos son grandes sincitios formados por muchas miofibras agrupadas que producen fuerzas y permiten el movimiento del cuerpo. Drosophila es un modelo clásico para estudiar la biología muscular. La combinación de la genética de Drosophila y los enfoques ómicos avanzados condujo a la identificación de moléculas conservadas clave que regulan la morfogénesis y la regeneración muscular. Sin embargo, la dinámica transcripcional de estas moléculas y la distribución espacial de su ARN mensajero dentro de los sincitios no pueden evaluarse mediante métodos convencionales. Aquí optimizamos un método existente de hibridación in situ de fluorescencia de ARN de una sola molécula (smFISH) para permitir la detección y cuantificación de moléculas individuales de ARNm dentro de los músculos de vuelo adultos y sus células madre musculares. Como prueba de concepto, hemos analizado la expresión y distribución del ARNm de dos factores de transcripción conservados evolutivamente, Mef2 y Zfh1/Zeb. Demostramos que este método puede detectar y cuantificar de manera eficiente moléculas individuales de ARNm para ambas transcripciones en las células precursoras musculares, los músculos adultos y las células madre musculares.

Introducción

Los músculos esqueléticos adultos están formados por miofibras multinucleadas diferenciadas cuyas propiedades contráctiles generan movimientos. El crecimiento, el mantenimiento y la regeneración muscular dependen de los progenitores musculares y de las células madre musculares (MuSC) que se especifican duranteel desarrollo embrionario. El programa miogénico está finamente controlado por un conjunto de factores de transcripción miogénicos (TF) centrales (p. ej., Pax3/7, MYOD, Mef2 y ZEB)2,3,4. Descifrar los mecanismos moleculares que regulan la biología muscular es importante para dilucidar cuestiones fundamentales relacionadas con la miología y para su posible uso terapéutico en el tratamiento de enfermedades degenerativas musculares.

Drosophila tiene una larga historia como modelo genético para estudiar la miogénesis5. Recientemente ha surgido como un nuevo modelo para investigar la regeneración muscular 6,7,8. La estructura muscular y los programas miogénicos centrales están altamente conservados entre moscas y mamíferos. Por ejemplo, los TF Mef2 y Zfh1/ZEB tienen una función conservada en la regulación del desarrollo y la regeneración muscular 3,9,10,11. Los músculos adultos de Drosophila, como los Músculos de Vuelo Indirecto (IFM, por sus siglas en inglés), se forman a partir de una población específica de MuSC, conocidos como Progenitores Musculares Adultos (AMP, por sus siglas en inglés)12. Estos AMP se especifican durante la embriogénesis y se asocian con estructuras epiteliales como los discos de las alas y las piernas. A lo largo de las etapas embrionarias y larvarias, los AMP permanecen indiferenciados hasta la metamorfosis, cuando se diferencian y fusionan para formar los IFM13,14. El TF Spalt mayor (spalt, salm) se expresa durante el desarrollo de los músculos de vuelo y es necesario para determinar su identidad estructural15. Mef2 es otro TF miogénico importante que es esencial para la formación muscular adulta 16,17. Se expresa en los AMP y se mantiene en los IFM adultos10,18. Mientras que la mayoría de los AMPs se diferencian en músculos funcionales, un subconjunto escapa a la diferenciación y forma los MuSCs adultos11. Al igual que en los vertebrados, el TF Zfh1/ZEB es necesario para evitar la diferenciación prematura de los MuSC adultos y para mantener su tallo 9,10.

Se ha demostrado que la dinámica de la expresión génica regula diversos procesos biológicos musculares19,20. El advenimiento de las técnicas de secuenciación de ARN de una sola célula y de un solo núcleo de alto rendimiento ha permitido una exploración exhaustiva de estas dinámicas transcripcionales21,22. Una limitación notable de estos enfoques es su incapacidad para proporcionar la distribución espacial de las moléculas de ARNm en las fibras musculares multinucleadas. Estas características pueden investigarse mediante hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) que revela dos tipos de cuerpos de ARNm: 1. Moléculas individuales de ARNm dispersas en el citoplasma y que representan el ARN maduro y 2. Un máximo de dos focos nucleares brillantes corresponden a la transcripción naciente y revelan los alelos transcripcionalmente activos23. Por lo tanto, smFISH es un método de elección para la cuantificación de moléculas individuales de ARNm, investigando su distribución espacial y proporcionando instantáneas de la dinámica transcripcional del gen.

El método smFISH se basa en un conjunto de sondas de oligonucleótidos fluorescentes cortas diseñadas específicamente para ser complementarias a la transcripción diana. Tras el recocido, genera fuentes puntuales de alta intensidad que permiten la detección de ARNm a nivel de una sola molécula mediante microscopía confocal24. Este método se aplica cada vez más para una amplia variedad de tipos de células, incluidos los tejidos musculares de mamíferos19,20. Sin embargo, en Drosophila, al igual que en otros modelos animales, la mayor parte del conocimiento sobre la expresión génica del músculo adulto se deriva de ensayos moleculares a granel, que carecen de información cuantitativa sobre la ubicación espacial de las moléculas de ARNm. Aquí optimizamos un método para realizar smFISH en células precursoras musculares y músculos adultos de Drosophila 23,25. Este protocolo incluye una canalización de análisis totalmente automatizada para la segmentación de núcleos y el recuento y localización de ARNm.

Protocolo

1. Disección y preparación del disco alar y del músculo adulto

NOTA: Limpie el banco de disección y todos los instrumentos de disección con una solución inhibidora de ARNasa (Tabla de materiales). Se deben usar guantes de laboratorio durante todo el procedimiento experimental.

  1. Disco de ala
    1. Coloque las larvas en etapa L3 en solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) 1x (Figura 1A).
    2. Enjuague las larvas 3 veces con 1x PBS y manténgalas en esta solución durante 5 minutos.
    3. Con dos pares de pinzas afiladas, sostenga la larva desde la parte anterior y tire y deseche el resto de los tejidos del cuerpo (alrededor de 2/3).
    4. Sostenga el primer 1/3 de la larva con un par de pinzas y los ganchos bucales con el otro par. Retraiga los ganchos bucales dentro de la larva hasta que esté completamente invertida.
      NOTA: Diseccione aproximadamente 30 larvas por experimento, para asegurar un tamaño de muestra adecuado para el análisis.
    5. Observe que los discos de las alas están estrechamente asociados con las dos ramas primarias de las tráqueas, que corren a lo largo de cada lado de la larva.
    6. Retire todos los demás componentes de la larva (discos de las patas y cerebro) para obtener un cadáver larvario invertido limpio con un par de discos de alas unidos a la tráquea (Figura 1B).
    7. Colocar las muestras en un tubo de centrífuga de 1 mL y fijarlas en paraformaldehído (PFA) al 4% diluido en 1x PBS durante 45 min a temperatura ambiente bajo agitación.
      NOTA: La agitación de la muestra se logra mediante un agitador oscilante (Tabla de Materiales).
    8. Lavar las muestras 3 x 5 min con etanol al 70% (EtOH, diluido en agua sin ARNasa) y almacenarlas en la misma solución de lavado a 4 °C durante al menos 2 días y hasta 1 semana.
  2. Músculos de vuelo indirecto
    1. Anestesiar a las moscas adultas en una almohadilla de CO2 y quitarles la cabeza, el abdomen, las patas y las alas.
    2. Coloque los tórax disecados en PBS frío 1x y continúe haciéndolo hasta que todas las muestras estén disecadas (Figura 1D).
    3. Prefije el tórax en PFA al 4% (Tritón al 1%) durante 20 min a temperatura ambiente bajo agitación.
    4. Enjuague las muestras 3 x 5 min con 1 solución de lavado de PBT (Triton al 1 % en 1 PBS).
    5. Coloque los tórax en una cinta adhesiva de doble cara (Tabla de Materiales) en un portaobjetos de vidrio y córtelos en dos con una cuchilla de micrótomo afilada para producir dos hemi-toragos (Figura 1E, F).
    6. Fijar las muestras en PFA al 4% (Triton al 1%) durante 45 min a temperatura ambiente bajo agitación.
    7. Lavar 2 x 20 min con 1x solución de lavado PBT (1% Triton, 1x PBS) a temperatura ambiente bajo agitación.
    8. Coloque las hemi-torazas en 1x PBS frío y use las pinzas para aislar suavemente las IFM de la hemi-toraza (Figura 1G).
      NOTA: Para lograr esto, es importante quitar la cutícula lo más a fondo posible.
    9. Para permeabilizar las muestras, almacene los IFM aislados en una solución de EtOH al 70% durante al menos 2 días y hasta 1 semana a 4 °C.
      NOTA: Aísle los IFM de aproximadamente 10 tórax por experimento para garantizar un tamaño de muestra adecuado para el análisis.

2. Hibridación, inmunotinción y montaje

NOTA: Se aplica un procedimiento de hibridación similar tanto para los discos de ala como para las muestras de IFM. Es fundamental aislar los discos de las alas de los cadáveres de las larvas y colocarlos en 200 μL de tampón A antes de comenzar la hibridación.

  1. Vuelva a suspender las sondas en 400 μL de tampón TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0) para obtener una solución madre final de 12,5 μM.
  2. Transfiera las muestras a un tubo de centrífuga de 0,5 ml que contenga el tampón A (tabla de materiales).
    NOTA: Al disminuir el volumen del recipiente, se hace más fácil visualizar las muestras y evitar perderlas durante el proceso de lavado.
  3. Lave las muestras 2 x 20 min con el tampón A.
  4. Aspirar el tampón A, sustituirlo por 400 μL del tampón de hibridación (Tabla de Materiales), y prehibridar las muestras durante 30 min a 37 °C en un mezclador térmico (Tabla de Materiales).
  5. Diluir las sondas hasta una concentración final de 125 nM para los discos de las alas y 200 nM para los músculos adultos, en el tampón de hibridación y añadir el anticuerpo primario.
    NOTA: La dilución del anticuerpo varía según el anticuerpo específico que se utilice (Tabla de materiales). La adición de anticuerpos es opcional. Los usuarios pueden optar por renunciar a la tinción de proteínas y, en su lugar, utilizar un protocolo smFISH similar que no incluye la adición de anticuerpos.
  6. Aspire el tampón de hibridación y reemplácelo con 100 μL de tampón de hibridación que contenga la sonda y el anticuerpo.
  7. Incubar las muestras en la oscuridad a 37 °C durante al menos 16 h bajo agitación de 300 rpm en un mezclador térmico.
  8. Calentar una alícuota del tampón A a 37 °C.
  9. Lavar las muestras durante 3 x 10 min en el mezclador térmico a 37 °C bajo agitación de 300 rpm.
  10. Durante el último lavado, diluir el anticuerpo secundario (1/200) y el DAPI (1/10.000) en el tampón A e incubar las muestras en esta solución a 37 °C durante al menos 1 h.
  11. Lave las muestras durante 3 x 20 min con el tampón B (Tabla de materiales).
  12. Transfiera con cuidado las muestras en un portaobjetos de microscopio, limpie el tampón B residual, agregue 30 μL de medio de montaje y cubra con un cubreobjetos de 18 x 18 mm. Usa un esmalte de uñas para sellar la preparación.
  13. Almacene las muestras durante un máximo de 1 semana a 4 °C.
    NOTA: Sin embargo, se recomienda realizar la obtención de imágenes lo antes posible para evitar la degradación de la señal de la sonda.

3. Imágenes

  1. Adquiera imágenes con un modo de adquisición xyz utilizando un microscopio confocal equipado con objetivos de inmersión en aceite de 40x y 63x (Tabla de materiales). La señal smFISH es detectada por el detector HyD a través de un modo de conteo de fotones.
  2. Localice las muestras utilizando la señal DAPI y la lámpara UV.
  3. Para obtener imágenes de los progenitores musculares asociados al disco del ala y los IFM (Figura 2 y Figura 3), aplique la siguiente configuración para las líneas láser y los filtros de emisión: seleccione DAPI (excitación (ej.) 405 nm, emisión (em.) 450 nm), Alexa Fluor 488 (ej. 496 nm, em. 519 nm), y Quasar 670 para las sondas smFISH (ej. 647 nm, em. 670 nm).
  4. Para obtener imágenes de los MuSC adultos (Figura 2D), aplique la siguiente configuración para las líneas láser y los filtros de emisión: seleccione DAPI (por ejemplo, 405 nm, em. 450 nm), Alexa Fluor 488 (ej. 496 nm, em. 519 nm), Alexa Fluor 555 (ej. 555 nm, em. 565 nm), y Quasar 670 para las sondas smFISH (ej. 647 nm, em. 670 nm).
    NOTA: Para la obtención de imágenes, las longitudes de onda se pueden adaptar de acuerdo con los colorantes asociados con los anticuerpos secundarios y las sondas.
  5. Guarde las imágenes confocales como . Archivos TIFF.

4. Análisis posterior a la obtención de imágenes

  1. Para empezar, inicia ImageJ y navega hasta el menú Plugins . Desde allí, seleccione Macros | Edite para abrir el código fuente de las macros.
    NOTA: Esto permitirá ajustar los parámetros según sea necesario y, si es necesario, modificar el directorio de carpetas para cada canal dentro del código fuente de la macro.
  2. Para seguir este protocolo y cuantificar las manchas Mef2 smFISH en larvas, utilice los siguientes ajustes: Log_radius = 3,0 y Log_quality = 20,0. Núcleos positivos de Segement Mef2 con desenfoque = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8.0; nucleus_size = 300.
  3. En las fibras musculares, utilice los siguientes parámetros: Log_radius = 2,5; Log_quality = 60,0; desenfoque = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0,0; nucleus_size = 300.
  4. Para iniciar la macro, simplemente ejecute el comando ejecutar y espere a que la macro cargue automáticamente todas las imágenes de la carpeta designada y las cuantifique de manera secuencial.
    NOTA: Tenga en cuenta que la duración de este proceso puede variar desde unos pocos segundos hasta varias horas, dependiendo del volumen de datos que se analicen.
  5. Busque los resultados que se muestran en dos nuevos archivos .csv: file_FISH_results y file_nuclei_results. El primero muestra el número de manchas transcripcionales y sus intensidades medias y máximas. El segundo da tanto el número total de núcleos como el número de puntos dentro de cada núcleo.

Resultados Representativos

En este protocolo, utilizamos sondas producidas comercialmente dirigidas al ARNm de Mef2 y zfh1. Diseñamos las sondas con el diseñador de sondas FISH (Tabla de Materiales) del fabricante. El conjunto Mef2 se dirige a los exones comunes a todas las isoformas de ARN Mef2 (desde el exón 3 hasta el exón 10). El conjunto zfh1 se dirige al tercer exón común a las isoformas 10 de zfh1-RB y zfh1-RE. Ambas sondas están conjugadas con el colorante fluorescente Quasar 670.

Generamos una macro internamente que era compatible con el software ImageJ para analizar automáticamente los datos .tif sin procesar. La macro permite la segmentación 3D de los núcleos por Cellpose26 con el plugin de Fiji BIOP y la cuantificación de puntos transcripcionales por un laplaciano de gaussiano como se implementa en el pluginTrackmate 27. El complemento MorpholibJ28 se utiliza para el procesamiento posterior (archivo complementario 1).

Como primer paso, realizamos smFISH en discos imaginales de alas, donde se sabe que Mef2 y zfh1 se expresan en los AMPs. Estos datos muestran que ambos transcritos se detectan uniformemente en la población de AMPs co-teñida con anticuerpos Mef2 o Zfh1 (Figura 2A,B). Los sitios de transcripción activos (TS) pueden ser revelados y distinguidos del ARNm maduro por smFISH, ya que tienden a ser más grandes y tienen señales más intensas que las transcripciones citoplasmáticas individuales o las transcripciones nucleares maduras. Consistentemente, los aumentos más altos de AMP distinguen entre los focos de TS y el ARNm maduro disperso en el citoplasma (Figura 2A', B'), lo que valida la sensibilidad de este protocolo smFISH. Cabe mencionar, sin embargo, que observamos un TS activo por núcleo tanto para zfh1 como para Mef2 (Figura 2A',B'). Estos datos validan aún más la precisión del diseño de la sonda, ya que los patrones transcripcionales de Mef2 y zfh1 en los AMP se colocalizan con la detección de sus respectivas proteínas (Figura 2).

En un segundo paso, examinamos el sitio de transcripción y la distribución de los ARNm de Mef2 y zfh1 en IFM adultos diferenciados y células madre asociadas (Figura 2C,D). Estos datos ilustran claramente los TS de Mef2 en los núcleos musculares sincitiales y la distribución del ARNm de Mef2 en todo el citoplasma (Figura 2C, C'). Zfh1 marca específicamente la población de MuSCs 10,11. Utilizando este protocolo smFISH, detectamos con éxito la transcripción de zfh1 en MuSCs marcados por la expresión de Zfh1-Gal4 > GFP. Un aumento mayor ilustra la detección tanto de zfh1 TS como de ARNm citoplasmáticos individuales (Figura 2D').

Por último, utilizamos nuestra macro ImageJ construida internamente para analizar cuantitativamente la dinámica transcripcional y la distribución espacial de Mef2. La canalización computacional puede detectar y segmentar de manera eficiente los puntos Mef2 y los núcleos musculares (Figura 3A-C). Sin embargo, debido a problemas de relación señal-ruido, es posible que algunos puntos no se detecten en ciertos casos (Figura 3A', B'). Utilizamos este método automatizado para investigar si la abundancia de ARNm de Mef2 varía entre las células precursoras musculares (AMP) y las IFM adultas diferenciadas. Nuestro análisis muestra que el número de ARNm de Mef2 por núcleo en los IFM adultos y los AMP no son significativamente diferentes (Figura 3D).

Para obtener información sobre la distribución espacial de los transcritos de Mef2 en músculos adultos de IFM, cuantificamos la fracción de puntos de ARNm de Mef2 citoplasmáticos frente a los nucleares (Figura 3E, F). Usando nuestro programa, contamos tanto el número total de manchas de ARNm Mef2 como el número de manchas de ARNm Mef2 que se superponen con la tinción de núcleos (Mef2). Al restar el ARNm asociado a los núcleos del número total de ARNm, se obtiene el número de manchas de ARNm citoplasmáticas. Nuestros hallazgos revelan que aproximadamente el 92% del ARNm de Mef2 está presente en el citoplasma, mientras que el 8% restante está asociado con núcleos musculares, como se muestra en la Figura 3E,F.

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Figura 1: Procedimiento para diseccionar y preparar los discos de las alas y las muestras de IFM para smFISH. (A) Larvas en estadio L3. (B) Extremo anterior de la larva disecado e invertido. Las flechas indican los discos de las alas. (C) Disco alar aislado. (D) Tórax adulto disecado. (E) Tórax adulto orientado sobre una cinta de doble cara antes de la bisección (línea punteada). (F) Hebitórax adulto. g) IFM aisladas. (H) Flujo de trabajo del protocolo smFISH. Abreviaturas: IFMs = músculos de vuelo indirectos; smFISH = hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única; EtOH = etanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes representativas de Mef2 y zfh1 smFISH en discos alares e IFM adultos. Los ARNm (A,B) Mef2 y zfh1 (púrpura) se detectan uniformemente en los AMP y se colocalizan con las proteínas (A,A') Mef2 y (B,B') Zfh1 (verde), respectivamente. (A'',B'') Mayor aumento de los AMP. (C) Los ARNm Mef2 y la proteína Mef2 se detectan en IFM adultos. (C') Mayor aumento de la región en caja en C. (D) La expresión Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP (verde) etiqueta a los MuSC adultos. zfh1 El ARN se detecta en las MuSC adultas. D') Mayor aumento de la región encuadrada en D. Los sitios de inicio de la transcripción de Zfh1 y los ARNm individuales se indican con flechas y puntas de flecha, respectivamente. Tinción DAPI (azul). Barras de escala = 50 μm (A,B,A',B'), 10 μm (A",B",C,D), 5 μm (C',D'). Abreviaturas: IFMs = músculos de vuelo indirectos; smFISH = hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única; AMPs = progenitores musculares adultos; MuSCs = células madre musculares; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; GFP = proteína verde fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Cuantificación de la transcripción de Mef2 y la acumulación de ARNm citoplasmático por smFISH. (A) Distribución de los transcritos de Mef2 (púrpura) y de la proteína Mef2 (verde) en IFM adultos de tipo salvaje. (A') Mayor aumento de la región en caja en A. Los sitios de inicio de la transcripción y los ARNm individuales se indican con flechas y puntas de flecha, respectivamente. (B,C) Búsqueda automática de puntos Mef2 y segmentación nuclear. Los ARNm citoplasmáticos y nucleares de Mef2 se indican en verde y magenta, respectivamente. (B',C') Mayores aumentos de regiones en caja en B y C. Los asteriscos indican puntos que no son contados por la macro. (D) Ejemplo de cuantificación puntual de Mef2 en AMP e IFM adultos, en relación con el número total de núcleos. (p = 0,0785, prueba t de Student, discos alares (n = 4), IFM (n = 11)). (E) Ejemplo de cuantificación de la distribución puntual de Mef2 en IFM adultos. (*** p< 0,0007, prueba t de Student, n = 5). (F) Porcentaje de manchas de ARNm Mef2 detectadas dentro y fuera de los núcleos (n = 5). Barras de escala = 10 μm (A,A'). Abreviaturas: IFMs = músculos de vuelo indirectos; smFISH = hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única; AMPs = progenitores musculares adultos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Macro utilizada para el posprocesamiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La aplicación del método smFISH ha ganado popularidad en los últimos tiempos, y su uso se ha extendido a varios tipos de células y organismos modelo. Sin embargo, en el caso de Drosophila, la mayor parte del conocimiento sobre la expresión génica del músculo adulto se deriva de ensayos moleculares a granel, que no proporcionan información cuantitativa sobre la ubicación espacial precisa de las moléculas de ARNm. Para abordar esta brecha, hemos optimizado un método para realizar smFISH en células precursoras musculares y músculos adultos de Drosophila . Este enfoque se ha adaptado de un protocolo publicado previamente23 y se ha optimizado para los tejidos musculares de Drosophila .

El principal obstáculo para obtener imágenes smFISH de alta calidad es el grosor de los músculos adultos, lo que dificulta la penetración óptima de las sondas. Por lo tanto, es crucial separar los músculos adultos de los demás tejidos del animal y llevar a cabo el proceso de hibridación con una leve agitación. Este paso en particular asegura una permeabilización efectiva de los tejidos.

Otro aspecto crítico es que la relación señal-ruido puede hacer que la canalización computacional falle en la detección de ciertos puntos de ARNm. Descubrimos que se puede lograr un aumento de la relación señal-ruido encontrando la concentración óptima de sondas. La dilución óptima puede diferir en función de la composición de cada conjunto de sondas, incluida la composición del colorante conjugado y los oligonucleótidos. Recomendamos probar diferentes diluciones; una dilución final de 200 nM produjo la mejor relación señal-ruido para tejidos adultos en estos experimentos.

Con el método smFISH, es posible cuantificar el número de ARN recién sintetizados en los focos TS. Cuando un gen se transcribe activamente, se producen múltiples ARN nacientes simultáneamente en el TS. Como resultado, la intensidad del TS superará a la del ARN citoplasmático maduro, y esta característica, combinada con su localización nuclear, puede diferenciar el TS de los ARN citoplasmáticos individuales. En el contexto de la biología muscular, la detección y cuantificación del ST es particularmente importante para determinar la sincronización de la transcripción de un gen específico entre núcleos musculares dentro del mismo sincitio. Sin embargo, esta canalización computacional no está diseñada para diferenciar entre señales citoplasmáticas de ARNm y TS. Como alternativa, sugerimos combinar este método smFISH con otras herramientas de análisis smFISH bien establecidas, como BayFISH o FISH-quant29,30. Se ha demostrado que estas herramientas facilitan la segmentación automatizada y los cálculos de intensidad de fluorescencia de agregados de ARN con una precisión notable.

Por último, aunque smFISH detecta moléculas de ARNm con alta resolución espacial, se limita a analizar un pequeño número de ARNm al mismo tiempo. Los métodos multiescala como merFISH (hibridación in situ de fluorescencia robusta con error multiplexado) permiten el análisis simultáneo de un gran número de ARNm31 diferentes. Al combinar sondas de oligonucleótidos y códigos de corrección de errores, este método facilita la detección de cientos de especies de ARN en células individuales.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Alain Vincent por su lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Ruth Lehmann por proporcionar el anticuerpo Zfh1. Agradecemos la ayuda de Stephanie Dutertre y Xavier Pinson para la microscopía confocal en la Plataforma de Imágenes MRic. EL cuenta con el apoyo de una beca de doctorado del ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA cuenta con el apoyo de la beca de doctorado AFM-Telethon 23846. TP está financiado por una subvención DAF de la Iniciativa Chan Zuckerberg a T.P. (2019-198009). HB cuenta con el apoyo de CNRS, el programa Atip Avenir y la subvención de trampolín AFM-Telethon 23108.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscope SP8LeicaSP8 DMI 6000
DAPIThermoFisher62248
Double-sided tape Tesa 57910-00000
Dumont #55 ForcepsFine Science Tools11255-20
Formaldehyde 16%EuromedexEM-15710
Mef2 antibodyDHSBNA
PBS 10xEuromedexET330
RNaseZAPSigma-AldrichR2020
Stellaris probesLGCNA
Stellaris RNA FISH Hybridization BufferLGCSMF-HB1-10
Stellaris RNA FISH Wash Buffer ALGCSMF-WA1-60
Stellaris RNA FISH Wash Buffer BLGCSMF-WB1-20
Swann-Morton BladesFisher scientific0210
ThermoMixerEppendorf5382000015
Triton X-100Euromedex2000
UAS-mCD8::GFP lineBloomingtonRRID:BDSC_5137
Ultrapure waterSigma-Aldrich95284
Watch Glass, Square, 1 5/8 in Carolina742300
Zfh1 antibodyGifted by Ruth Leahman
Zfh1-Gal4BloomingtonBDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625

Referencias

  1. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  2. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  3. Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
  4. Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
  5. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  6. Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112 (2021).
  7. Bothe, I., Baylies, M. K. Drosophila myogenesis. Current Biology. 26 (17), R786-R791 (2016).
  8. Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459 (2022).
  9. Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364 (2019).
  10. Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954 (2018).
  11. Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107 (2017).
  12. Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126 (2014).
  13. Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
  14. Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497 (2015).
  15. Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  16. Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
  17. Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
  18. Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
  19. Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388 (2021).
  20. Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079 (2021).
  21. Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432 (2022).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
  23. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  24. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  25. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
  26. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  27. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  28. Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
  29. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  30. Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164 (2017).
  31. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).

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