Desarrollo y Aplicación de Ensayos Biofísicos para la Evaluación de la Formación de Complejos Ternarios Inducida por Quimeras Dirigidas a la Proteólisis (PROTACS)

Resumen

En este trabajo se describen protocolos para la caracterización biofísica de la formación de complejos ternarios inducidos por quimeras dirigidas a proteólisis (PROTACS) que involucran a las ubiquitinas ligasa Von Hippel-Lindau E3 ligasa (VHL) y Cereblon (CRBN). Los métodos biofísicos que se ilustran en este documento incluyen la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la interferometría de biocapas (BLI) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC).

Resumen

Las ligasas E3 y las proteínas destinadas a la degradación pueden ser inducidas a formar complejos por moléculas heterobifuncionales en un proceso de varios pasos. La cinética y la termodinámica de las interacciones involucradas contribuyen a la eficiencia de la ubiquitinación y la degradación resultante de la proteína. Las técnicas biofísicas como la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la interferometría de biocapas (BLI) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) proporcionan información valiosa que se puede utilizar en la optimización de esas interacciones. Utilizando dos sistemas modelo, se estableció un conjunto de herramientas de ensayo biofísico para comprender la cooperatividad de la formación de complejos ternarios y el impacto del "efecto gancho" en la cinética de unión. En un caso, se evaluó una molécula de proteólisis dirigida a quimera (PROTAC) que indujo la formación de complejos ternarios entre Brd4^BD2 y VHL. La molécula heterobifuncional, MZ1, tiene afinidades nM tanto por la proteína Brd4^BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) como por el complejo BVS (SPR K_D = 29 nM, ITC K_D = 66 nM). Para este sistema, se desarrollaron ensayos robustos de SPR, BLI e ITC que reprodujeron los resultados publicados que demuestran la cooperatividad de la formación de complejos ternarios. En el otro caso, se estudió una molécula que indujo complejos ternarios entre una proteína de 46,0 kDa, PPM1D, y cereblon [CRBN (319-442)]. La molécula heterobifuncional, BRD-5110, tiene una SPR K D = 1 nM para PPM1D pero una unión mucho más débil contra el complejo CRBN truncado (319-442) (SPR K_D = ~ 3 μM). En ese caso, la unión de CRBN en SPR no era saturable, lo que daba lugar a un "efecto gancho". Se evaluaron los requisitos de rendimiento y reactivos para SPR, BLI e ITC, y se proporcionaron recomendaciones generales para su aplicación a los proyectos PROTAC.

Introducción

La poliubiquitinación de proteínas en la célula es un proceso estrechamente regulado que involucra enzimas de la familia de la ubiquitina ligasa ^1,2. Las enzimas terminales en la vía son las ligasas de ubiquitina E3 que unen covalentemente las moléculas de ubiquitina a sus socios de unión a proteínas³. La poliubiquitinación de esos socios de unión a proteínas se dirige a ellos para la degradación proteolítica por el proteasoma⁴. Este sistema forma parte del proceso de homeostasis de proteínas que se ha aprovechado terapéuticamente para inducir la degradación de p....

Protocolo

Todas las proteínas fueron sobreexpresadas en E. coli con buen rendimiento y pureza (>80%) siguiendo los protocolos de la literatura¹⁸. La biotinilación se llevó a cabo mediante una reacción catalizada por BirA¹⁸. Todas las moléculas pequeñas se prepararon en soluciones madre de 1 mM en 100% DMSO. Los procedimientos descritos en este documento no requieren equipo de seguridad de laboratorio especializado ni precauciones. Se debe usar equipo de protección personal (EPP) estándar de laboratorio (es decir, bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes).

Las proteínas aplicadas en est....

Resultados

La caracterización del complejo binario BVS: MZ1 y del complejo ternario BVS: MZ1: Brd4^BD2 se puede encontrar en la Figura 2 (ITC), la Figura 3 (BLI) y la Figura 4 (SPR) utilizando un tampón muy similar. El K_D extraído de los ensayos ortogonales es consistente. La cooperatividad se puede calcular por K D (binario) / K_D (ternario), que es altamente positivo (15 de ITC o 26 de SPR).

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Discusión

La caracterización biofísica de las interacciones binarias y ternarias entre las moléculas PROTAC y sus socios de unión a proteínas puede proporcionar información única y complementaria en relación con los sistemas celulares ampliamente utilizados. Comprender la afinidad entre cada ojiva de una molécula PROTAC y sus socios de unión a proteínas puede ayudar a guiar los esfuerzos de química médica hacia la optimización de esas interacciones. Las estructuras cristalinas de los complejos ternarios PROTAC public.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments