Identificación, diagnóstico y clasificación de tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos en modelos de ratón modificados genéticamente

Resumen

Hemos desarrollado una metodología para evaluar si las neoplasias del sistema nervioso en ratones modificados genéticamente recapitulan con precisión la patología de sus homólogos humanos. Aquí, aplicamos estas técnicas histológicas, criterios patológicos definidos y metodologías de cultivo a neurofibromas y tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos que surgen en el modelo de ratón P 0-GGFβ3.

Resumen

Los pacientes con neurofibromatosis tipo 1 (NF1) del síndrome de susceptibilidad tumoral autosómica dominante suelen presentar neurofibromas plexiformes (NP) que posteriormente se transforman en tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST) muy agresivos. La comprensión del proceso por el cual una NP se transforma en una MPNST se vería facilitada por la disponibilidad de modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) que replican con precisión la progresión de la NP-MPNST observada en humanos con NF1. Desafortunadamente, los modelos GEM con ablación de Nf1 no recapitulan completamente este proceso. Esto nos llevó a desarrollar ratones P 0-GGFβ3, un modelo GEM en el que la sobreexpresión del mitógeno de la célula de Schwann neuregulina-1 (NRG1) en las células de Schwann da lugar al desarrollo de NPs que progresan hasta convertirse en MPNSTs con alta frecuencia. Sin embargo, para determinar si la tumorigénesis y la progresión neoplásica en ratones P 0-GGFβ3 modelan con precisión los procesos observados en pacientes con NF1, primero tuvimos que demostrar que la patología de los tumores de la vaina del nervio periférico P_0-GGFβ3 recapitula la patología de sus homólogos humanos.

En este trabajo se describen las metodologías especializadas utilizadas para diagnosticar y clasificar con precisión las neoplasias del sistema nervioso periférico en modelos GEM, utilizando P 0-GGFβ3 y P_0-GGFβ3; Trp53^+/- ratones como ejemplo. Describimos los métodos histológicos, inmunohistoquímicos e histoquímicos utilizados para diagnosticar NP y MPNST, cómo distinguir estas neoplasias de otros tipos de tumores que imitan su patología y cómo clasificar estas neoplasias. Discutimos el establecimiento de cultivos de paso temprano a partir de MPNST GEM, cómo caracterizar estos cultivos mediante inmunocitoquímica y cómo verificar su tumorigénesis mediante el establecimiento de aloinjertos. En conjunto, estas técnicas caracterizan la patología de las NP y MPNST que surgen en los modelos GEM y comparan críticamente la patología de estos tumores murinos con sus homólogos humanos.

Introducción

Durante las últimas tres décadas, numerosos laboratorios han intentado crear modelos de ratón de cánceres humanos mediante la introducción de mutaciones asociadas al cáncer humano en el genoma del ratón o mediante la sobreexpresión de un producto génico que se sobreexpresa en los cánceres humanos. Los modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) resultantes se pueden utilizar para una variedad de propósitos, como establecer que la modificación genómica recién introducida inicia la tumorigénesis, identificar otros cambios genéticos o epigenéticos que ocurren posteriormente y que contribuyen a la progresión tumoral y definir las vías de señalización clave que impuls....

Protocolo

Los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por la IACUC de la Universidad Médica de Carolina del Sur y fueron realizados por personal debidamente capacitado de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las pautas institucionales de cuidado de animales de MUSC.

1. Determinación de la penetrancia tumoral y la supervivencia en ratones P 0-GGFβ3 e identificación de tumores en estos animales para su posterior caracterización

1. Generar la cohorte de ratones que serán evaluados para tumorigénesis. El número de ratones necesarios depende de la penetrancia del fenoti....

Discusión

Los métodos histológicos y bioquímicos presentados aquí proporcionan un marco para el diagnóstico y la caracterización de los modelos GEM de neurofibroma y patogénesis MPNST. A lo largo de los años, hemos encontrado que estas metodologías son de gran utilidad para evaluar la patología de los tumores de la vaina de los nervios periféricos que surgen en los modelos GEM 21,25,26. Sin embargo, si bien los protocolos descr.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31