Aplicación de la tinción de mitocondrias vivas en la clasificación celular para purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Resumen

Los hepatocitos derivados de células madre pluripotentes se pueden purificar a través de la clasificación celular, utilizando una combinación de tinción de moléculas de adhesión de células leucocitarias mitocondriales y activadas (ALCAM, también conocida como CD166).

Resumen

Las células madre embrionarias humanas (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS) tienen aplicaciones potenciales en la medicina regenerativa basada en células para el tratamiento de órganos gravemente enfermos debido a su proliferación ilimitada y propiedades pluripotentes. Sin embargo, diferenciar las células ES/iPS humanas en tipos de células diana 100% puras es un reto debido a su alta sensibilidad al medio ambiente. La tumorigénesis después del trasplante es causada por células contaminadas, proliferantes e indiferenciadas, lo que hace que la tecnología de alta purificación sea esencial para la realización segura de la medicina regenerativa. Para mitigar el riesgo de tumorigénesis, se ha desarrollado una tecnología de alta purificación para hepatocitos derivados de células iPS humanas. El método emplea FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) utilizando una combinación de alto contenido mitocondrial y el marcador de superficie celular ALCAM (molécula de adhesión celular leucocitaria activada) sin modificación genética. El 97% ± 0,38% (n = 5) de los hepatocitos purificados mediante este método mostraron expresión de la proteína albúmina. Este artículo tiene como objetivo proporcionar procedimientos detallados para este método, aplicados al método de diferenciación bidimensional más actual para células iPS humanas en hepatocitos.

Introducción

Las células madre pluripotentes embrionarias e inducidas (ES e iPS, respectivamente) se consideran fuentes celulares prometedoras para terapias regenerativas. Sin embargo, la eficiencia de diferenciar estas células en tipos específicos de células objetivo puede variar, incluso cuando se utiliza la misma línea celular, protocolo y experimentador 1,2,3,4. Esta variabilidad puede atribuirse a la alta sensibilidad de las células ES/iPS humanas a su entorno. Por lo tanto, actualmente es difícil obtener de manera consistente células diana puras. P....

Protocolo

En este estudio se utilizaron células iPS humanas obtenidas comercialmente (cepa 253G1) (véase la Tabla de Materiales).

1. Mantenimiento de las células iPS humanas

1. Mantener las células iPS humanas en condiciones libres de alimentador en medio AK02 en placas de cultivo recubiertas con iMatrix-511 de 0,25 μg/^cm2 (ver Tabla de Materiales).

2. Diferenciación hepática de células iPS humanas en cultivos 2D

NOTA: Consulte la Figura 1A para ver el programa diario de difere....

Discusión

Debido a sus funciones en el metabolismo de nutrientes y la desintoxicación, los hepatocitos poseen un número relativamente grande de mitocondrias en comparación con otros tipos de células¹⁵. ALCAM es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y desempeña un papel en la adhesión y migración celular. Se expresa en varios tipos de células, incluyendo células hepáticas, epiteliales, linfocíticas, mieloides, fibroblastos y neuronales¹⁶. Mediante la utiliza.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159