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Resumen

Se presenta un protocolo para el cribado de fármacos de alto rendimiento para mejorar el sueño mediante el seguimiento del comportamiento del sueño de las moscas de la fruta en un modelo de Drosophila de edad avanzada.

Resumen

El sueño, un componente esencial de la salud y el bienestar general, a menudo presenta desafíos para las personas mayores que experimentan con frecuencia trastornos del sueño caracterizados por una duración del sueño más corta y patrones fragmentados. Estas interrupciones del sueño también se correlacionan con un mayor riesgo de diversas enfermedades en las personas mayores, como diabetes, enfermedades cardiovasculares y trastornos psicológicos. Desafortunadamente, los medicamentos existentes para los trastornos del sueño se asocian con efectos secundarios significativos, como deterioro cognitivo y adicción. En consecuencia, se necesita urgentemente el desarrollo de nuevos medicamentos para los trastornos del sueño, más seguros y más eficaces. Sin embargo, el alto costo y la larga duración experimental de los métodos actuales de detección de drogas siguen siendo factores limitantes.

Este protocolo describe un método de cribado rentable y de alto rendimiento que utiliza Drosophila melanogaster, una especie con un mecanismo de regulación del sueño altamente conservado en comparación con los mamíferos, lo que lo convierte en un modelo ideal para estudiar los trastornos del sueño en los ancianos. Al administrar varios compuestos pequeños a moscas envejecidas, podemos evaluar sus efectos sobre los trastornos del sueño. Los comportamientos de sueño de estas moscas se registran mediante un dispositivo de monitorización infrarroja y se analizan con el paquete de datos de código abierto Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Este protocolo ofrece un enfoque de detección de bajo costo, reproducible y eficiente para la regulación del sueño. Las moscas de la fruta, debido a su corto ciclo de vida, bajo costo de cría y facilidad de manejo, sirven como excelentes sujetos para este método. A modo de ilustración, la reserpina, uno de los fármacos probados, demostró la capacidad de promover la duración del sueño en moscas ancianas, destacando la eficacia de este protocolo.

Introducción

El sueño, uno de los comportamientos esenciales necesarios para la supervivencia humana, se caracteriza por dos estados principales: el sueño de movimientos oculares rápidos (REM) yel sueño de movimientos oculares no rápidos (NREM). El sueño NREM comprende tres etapas: N1 (la transición entre la vigilia y el sueño), N2 (sueño ligero) y N3 (sueño profundo, sueño de ondas lentas), que representan la progresión de la vigilia al sueño profundo1. El sueño juega un papel crucial tanto en la salud física como en la mental2. Sin embargo, el envejecimiento reduce la duración total del sueño, la eficiencia del sueño, el porcentaje de sueño de ondas lentas y el porcentaje de sueño REM en adultos3. Las personas mayores tienden a pasar más tiempo en sueño ligero en comparación con el sueño de ondas lentas, lo que los hace más sensibles a los despertares nocturnos. A medida que aumenta el número de despertares, el tiempo medio de sueño disminuye, lo que da lugar a un patrón de sueño fragmentado en los ancianos, que puede estar asociado a una excitación excesiva de las neuronas Hcrt en ratones4. Además, las disminuciones relacionadas con la edad en los mecanismos circadianos contribuyen a un cambio más temprano en la duración del sueño 5,6. En combinación con las enfermedades físicas, el estrés psicológico, los factores ambientales y el uso de medicamentos, estos factores hacen que los adultos mayores sean más susceptibles a los trastornos del sueño, como el insomnio, el trastorno del comportamiento del sueño REM, la narcolepsia, los movimientos periódicos de las piernas, el síndrome de piernas inquietas y los trastornos respiratorios del sueño 7,8.

Los estudios epidemiológicos han demostrado que los trastornos del sueño están estrechamente relacionados con las enfermedades crónicas en los ancianos9, incluyendo la depresión 10, las enfermedades cardiovasculares11 y la demencia12. Abordar los trastornos del sueño desempeña un papel crucial en la mejora y el tratamiento de las enfermedades crónicas y en la mejora de la calidad de vida de los adultos mayores. En la actualidad, los pacientes recurren principalmente a fármacos como las benzodiacepinas, las no benzodiacepinas y los agonistas de los receptores de melatonina para mejorar la calidad del sueño13. Sin embargo, las benzodiacepinas pueden conducir a una regulación negativa de los receptores y a la dependencia después de un uso prolongado, causando síntomas graves de abstinencia tras la interrupción14,15. Los medicamentos no benzodiacepinas también conllevan riesgos, como demencia16, fracturas17 y cáncer18. El agonista del receptor de melatonina de uso común, el ramelteón, reduce la latencia del sueño, pero no aumenta la duración del sueño y tiene problemas relacionados con la función hepática debido a la extensa eliminación del primer paso19. La agomelatina, un agonista de los receptores de melatonina y antagonista de los receptores de serotonina, mejora el insomnio relacionado con la depresión, pero también presenta un riesgo de daño hepático20. En consecuencia, existe una necesidad urgente de medicamentos más seguros para tratar o aliviar los trastornos del sueño. Sin embargo, las estrategias actuales de cribado de fármacos, basadas en experimentos moleculares y celulares combinados con sistemas automatizados y análisis informáticos, son costosas y requieren mucho tiempo21. Las estrategias de diseño de fármacos basadas en la estructura, que se basan en la estructura y las propiedades de los receptores, requieren una comprensión clara de la estructura tridimensional de los receptores y carecen de capacidades predictivas de los efectos de los fármacos22.

En el año 2000, con base en los criterios de sueño propuestos por Campbell y Tobler en 1984 23, los investigadores establecieron modelos animales simples para estudiar el sueño 24, incluyendo Drosophila melanogaster, que exhibía estados similares al sueño25,26. A pesar de las diferencias anatómicas entre Drosophila y los humanos, muchos componentes neuroquímicos y vías de señalización que regulan el sueño en Drosophila se conservan en el sueño de los mamíferos, facilitando el estudio de las enfermedades neurológicas humanas27,28. Drosophila también se utiliza ampliamente en los estudios del ritmo circadiano, a pesar de las diferencias en los osciladores centrales entre moscas y mamíferos 29,30,31. Por lo tanto, Drosophila sirve como un valioso organismo modelo para estudiar el comportamiento del sueño y realizar pruebas de detección de drogas relacionadas con el sueño.

Este estudio propone un enfoque rentable y sencillo basado en el fenotipo para el cribado de fármacos de moléculas pequeñas para tratar los trastornos del sueño utilizando moscas envejecidas. La regulación del sueño en Drosophila está altamente conservada25, y la disminución del sueño observada con la edad puede ser reversible mediante la administración de fármacos. Por lo tanto, este método de detección basado en el fenotipo del sueño puede reflejar intuitivamente la eficacia del fármaco. Alimentamos a las moscas con una mezcla del fármaco investigado y la comida, monitorizamos y registramos el comportamiento del sueño utilizando el Drosophila Activity Monitor (DAM)32 y analizamos los datos adquiridos utilizando el paquete de datos SCAMP2020 de código abierto de MATLAB (Figura 1). El análisis estadístico se realiza mediante estadísticas y software de gráficos (ver Tabla de Materiales). A modo de ejemplo, demostramos la efectividad de este protocolo mediante la presentación de datos experimentales sobre la reserpina, un inhibidor de molécula pequeña del transportador vesicular de monoaminas que se ha reportado que aumenta el sueño33. Este protocolo proporciona un enfoque valioso para identificar medicamentos para tratar los problemas de sueño relacionados con la edad.

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Protocolo

Este protocolo utiliza las moscas w1118 de 30 días de edad del Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, ver Tabla de Materiales).

1. Preparación de las moscas de la fruta envejecidas

  1. Preparación de alimentos
    1. Prepare un medio de cultivo estándar de almidón de maíz mezclando 50 g/L de copos de maíz, 110 g/L de azúcar, 5 g/L de agar y 25 g/L de levadura. Calentar los copos de maíz y la levadura con agua para gelatinizar, y luego disolver completamente todas las sustancias.
    2. Cuando el medio se enfríe a 50-60 °C, agregue 6 ml/l de ácido propiónico y envase rápidamente en frascos de cultivo.
  2. Cría de moscas y preparación de moscas envejecidas
    1. Criar la cepa de mosca w1118en frascos que contengan un medio de cultivo estándar de almidón de maíz y colocar los frascos en una incubadora de temperatura constante a 25 ° C, 68% de humedad relativa, condiciones de iluminación de 500-1000 lux y un ciclo de luz: oscuridad de 12 h: 12 h.
    2. Transfiera las moscas a una nueva botella cada 7 días de acuerdo con el ciclo de crecimiento de las moscas, manteniendo constante la edad de los individuos en la misma botella.
    3. Recoja el nuevo lote de moscas que eclosionan de la botella original 3 días después de transferirlas y colóquelas en una botella nueva. Siguiendo el principio de cambiar el frasco cada 7 días, se cultivarán hasta alrededor de los 30 días de edad.

2. Preparación de alimentos medicinales y tubos de vidrio para monitoreo

NOTA: El procedimiento para la preparación de tubos de vidrio sigue el trabajo de Jin et al. con modificaciones34.

  1. Limpieza y secado de tubos de vidrio
    1. Coloque el tubo de vidrio (5 mm de diámetro x 65 mm de largo, consulte la tabla de materiales) en un vaso de precipitados grande, sumérjalo y hiérvalo con agua destilada doble durante 20 minutos. Repita 3 veces.
    2. Retire y agrupe el tubo de vidrio, enjuague el interior con agua destilada doble de 3 a 5 veces y colóquelo en un horno para que se seque.
  2. Preparación del medio de cultivo simple (100 mL)
    1. Disuelva 1,5 g de agar y 5 g de sacarosa en agua bidestilada, caliente y concentre hasta 100 ml.
    2. Añadir 600 μL de ácido propiónico cuando el medio se enfríe a unos 70 °C, evitando que se solidifique con un baño de agua a temperatura constante.
    3. Agregue aproximadamente 4 ml de medio simple y reserpina (ver Tabla de materiales) en un vaso de precipitados pequeño de 10 ml hasta que el fármaco alcance 20 μM o 50 μM. Agregue dimetilsulfóxido (DMSO) a la concentración de 0.2% en el grupo de control negativo.
  3. Preparación de los tubos de vidrio que contienen medicamentos
    1. Para facilitar el flujo del medio, inserte con cuidado una longitud adecuada de tubo de vidrio en un vaso de precipitados pequeño. El medio entrará naturalmente en el tubo de vidrio debido a la presión atmosférica.
    2. Saque el tubo de vidrio cuando el medio de cultivo esté completamente solidificado y limpie la pared exterior para obtener un tubo de vidrio de monitoreo con un medio de cultivo que contenga medicamentos en un extremo.
    3. Calentar la parafina sólida en un vaso de precipitados hasta que se derrita a 70 °C, acercar el extremo del tubo de vidrio a los alimentos en el líquido de parafina durante unos 5 mm y retirarlo rápidamente. Espere a que la parafina se solidifique para sellar el extremo alimenticio del tubo de vidrio.

3. Diseño experimental y tratamiento de moscas

  1. Diseñar el experimento para el tratamiento con mosca siguiendo la Tabla 1.

4. Montaje de Drosophila y monitorización del sueño

NOTA: El procedimiento para el ensamblaje de Drosophila sigue el trabajo de Jin et al.34 con modificaciones.

  1. Anestesiar las moscas con gas CO2 , colocarlas en tubos de vidrio sellados con parafina (uno por tubo) y bloquear el extremo no alimentario con una bola de algodón absorbente para evitar que las moscas se escapen y asegurar la circulación del aire.
  2. Cargue los tubos en el monitor infrarrojo para monitorearlos.
    1. Ensamble los tubos de vidrio que contienen moscas en un monitor infrarrojo en la misma dirección y registre el número de monitor y el número de orificio correspondiente a cada medicamento.
    2. Ajusta la alineación de cada tubo y haz que los rayos infrarrojos pasen verticalmente por el centro del rango de actividad de la mosca.
    3. Coloque el monitor dentro de una incubadora a 25 °C ubicada en el cuarto oscuro del sueño de moscas, siguiendo la configuración especificada: temperatura de 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (equivalente a la hora local de las 08:00 p.m.) y ZT24 (equivalente a la hora local de las 08:00 a.m.). Esta configuración asegura que las moscas experimenten períodos alternos de 12 h de luz y oscuridad.
      NOTA: Trate de no abrir la puerta hasta que se complete la recopilación de datos de monitoreo para mantener un ambiente estable en la incubadora durante el monitoreo.
    4. Inicie la supervisión utilizando el sistema DAM2 (consulte la Tabla de materiales).
    5. Una vez que se complete el monitoreo, descargue los datos recopilados en formato .txt del sistema.

5. Tratamiento de datos

NOTA: El procesamiento de datos utilizando el sistema DAM, DAMFileScan107 y SCAMP se realizó de acuerdo con las instrucciones de sus sitios web oficiales (ver Tabla de Materiales).

  1. Importe el archivo txt anterior al software DAMFileScan107 para escanearlo y divídalo según sea necesario para obtener los datos de sueño.
    1. Establezca la hora de inicio de los datos de segmentación en 8:01 (segmentación de 1 minuto) u 8:00 (segmentación de 30 minutos) de la tercera mañana después de iniciar los monitores, y la hora de finalización es a las 8:00 a.m. tres días después de la hora de inicio (Figura 2A1).
      NOTA: Las moscas deben adaptarse al entorno de monitoreo durante al menos un día. Por lo tanto, se puede establecer la hora de inicio de los datos divididos a las 8 a.m. del tercer día después de que comience el monitor.
    2. Divida los datos a intervalos de 1 min y 30 min. Cambie la opción "Longitud del contenedor" a 1 minuto, cambie la opción "Tipo de archivo de salida" a Archivos de canal, cambie el nombre y la salida. El método de segmentación de datos de 30 minutos es el mismo que el anterior (Figura 2A2-5).
      NOTA: Al realizar la segmentación de datos a intervalos de 1 minuto y 30 minutos, el cambio de nombre final de los dos archivos debe ser coherente; de lo contrario, puede ser ilegible durante el procesamiento posterior de Matlab. Si es necesario, el nombre del archivo se puede cambiar después de la salida para facilitar la diferenciación.
  2. Tratamiento de datos mediante SCAMP2020
    1. Abra el paquete del programa SCAMP2020 en Matlab y haga doble clic en Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figura 2B).
    2. Agregue su subcarpeta "Vecsey SCAMP Scripts" a la ruta, busque el archivo "scamp.m" en esa carpeta y ejecútelo. En la siguiente ventana emergente, seleccione las carpetas de proceso de 1 minuto y 30 minutos en secuencia (Figura 2C, D).
    3. Seleccione un monitor, haga clic en Cargar gráficos de visualización individuales para obtener una vista previa (Figura 3A1) y verifique la imagen que aparece. Desmarque el canal correspondiente de moscas muertas (Figura 3A2, Figura 3B).
    4. Repita los pasos anteriores para comprobar todos los monitores.
    5. Cambie el nombre de cada canal de cada monitor en función del fármaco correspondiente que se va a probar (Figura 3A3), seleccione todos los monitores y haga clic en ANALIZAR datos seleccionados para el análisis (Figura 3A4).
    6. De forma predeterminada en la opción seleccionada, haga clic en Analizar para la ubicación elegida, marque Exportar datos y, finalmente, haga clic en GRÁFICO 30 minutos Tipos de datos para todos los días para grupos seleccionados y EXPORTAR todos los datos para generar los resultados (Figura 3C).
  3. Seleccione el archivo denominado s30 del archivo CSV, busque el valor medio correspondiente y los datos de error estándar para cada monitor, haga una copia de seguridad en Excel para modificarlo y ajustarlo, y péguelo en GraphPad Prism (consulte la Tabla de materiales) para dibujar un diagrama de estado de suspensión (Figura 4A, B).
  4. Busque el archivo llamado "stdur" y calcule los valores promedio de sueño diurno, nocturno y total para cada mosca dentro de los tres días (Figura 4A, C). Pegue los datos en el software Prism para completar la prueba de diferencia y dibuje un gráfico.

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Resultados

La reserpina es un inhibidor de molécula pequeña del transportador vesicular de monoaminas (VMAT), que inhibe la recaptación de monoaminas en las vesículas presinápticas, lo que conduce a un aumento del sueño33. Se examinaron los efectos de la reserpina como promotores del sueño en moscas de 30 días de edad, y el grupo de control se alimentó únicamente con el disolvente dimetilsulfóxido (DMSO). En el grupo de Reserpina, las moscas más viejas mostraron un aumento significativo del sueñ...

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Discusión

El método descrito es adecuado para la detección rápida de medicamentos para dormir pequeños y medianos. En la actualidad, la mayoría de los métodos convencionales de detección de fármacos de alto rendimiento se basan en los niveles bioquímicos y celulares. Por ejemplo, se examina la estructura y las propiedades del receptor para buscar ligandos específicos que puedan unirse a él22. Otro enfoque consiste en analizar el modo de unión y la fuerza de los fragmentos moleculares de fármaco...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio del Prof. Junhai Han por su discusión y comentarios. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 32170970 a Y.T y el "Proyecto Azul de Cianina" de la provincia de Jiangsu a Z.C.Z.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AgerBIOFROXX8211KG001
Artificial Climate BoxPRANDTPRX-1000Aofficial website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity MonitorTriKineicsDAM2official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2systemTriKineicsversion:v3.03official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScanTriKineicsversion:1.0.7.0official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl SulfoxideSIGMA276855
Drosophila Activity Monitoring IncubatorTritech ResearchDT2-CIRC-TKofficial website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila BottlesBiologix51-17720official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118Bloomington Drosophila Stock Center BDSC_3605
ExcelMicrosoftversion:Excel 2016official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubesTriKineticsPPT5x65official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022bMathWorksversion:9.13.0.2049777official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
PrismGraphPadVersion:Prism 8.0.1official website:https://www.graphpad.com/features
ReserpineMACKLINR817202-1g
SaccharoseSIGMA1245GR500
SCAMPVecsey LabN/Aofficial website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

Referencias

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