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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

A través de la incorporación del diseño de la experiencia de interacción y el análisis de los requisitos del usuario, presentamos un innovador raspador celular que mejora los ensayos de curación de heridas celulares en términos de reproducibilidad, confiabilidad, practicidad, integridad celular y experiencia del usuario.

Resumen

La fiabilidad de la medición de la migración celular en los ensayos de cicatrización de heridas se ve frecuentemente socavada por la inestabilidad metodológica prevalente, es decir, el método basado en puntas. Presentamos un instrumento innovador diseñado para abordar estas limitaciones. Nuestro novedoso raspador de células supera el enfoque actual, generando un espacio libre de células más consistente y estable. Experimentos biológicos repetidos revelan que el espacio libre de células producido por el raspador de células exhibe bordes más rectos y tamaño y forma uniformes en comparación con la técnica basada en la punta (p < 0.05). En cuanto al diseño del producto, el rascador de células cuenta con una combinación de colores refinada adecuada para entornos de laboratorio, lo que mejora el seguimiento de los resultados experimentales y permite la esterilización mediante autoclave para su reutilización. En particular, después del tratamiento, el raspador celular demuestra un efecto insignificante sobre la viabilidad y proliferación celular (97,31% y 24,41%, respectivamente). Por el contrario, el método basado en puntas produce una menor viabilidad celular (91,37%) y proliferación (18,79%). Esta investigación presenta el raspador celular como un dispositivo novedoso y reutilizable capaz de generar brechas libres de células reproducibles al tiempo que preserva la viabilidad celular, aumentando así la fiabilidad de los ensayos de cicatrización de heridas en comparación con las técnicas existentes.

Introducción

Los tumores se caracterizan por características distintivas, como las ventajas de crecimiento selectivo, el recableado metabólico y la modulación inmunitaria, todo lo cual contribuye intrigantemente a mejorar la migración celular, un comportamiento maligno crítico de las células tumorales. Esta característica afecta directamente a la metástasis a distancia del tumor primario, comprometiendo la supervivencia a largo plazo de los pacientes 1,2,3. Las ventajas del crecimiento selectivo permiten que las células cancerosas superen a las células normales, mientras que el recableado metabólico apoya esta rápida proliferación al alterar las vías de energía. Al mismo tiempo, la modulación inmunitaria permite a los tumores evadir las defensas del organismo. Los estudios subrayan la gravedad de este problema, mostrando que la metástasis pulmonar, a menudo como resultado de una mayor migración celular, es un evento terminal que conduce a la muerte de pacientes con varios cánceres4. Por ejemplo, los cánceres de mama5, carcinoma de cuello uterino4 y osteosarcoma6 representan el 20%, 9% y 30% de estos casos, respectivamente. Por lo tanto, la evaluación de la migración de células tumorales se ha convertido en una parte integral de la investigación oncológica actual, lo que destaca aún más la naturaleza multifacética de la progresión tumoral.

El ensayo de cicatrización de heridas celulares es un método fácil de usar para medir la migración celular in vitro , a menudo empleado en estudios oncológicos7. La mayoría de los experimentadores utilizan puntas de pipeta para crear heridas celulares manualmente8. Aunque este método podría formar heridas celulares de forma rápida y cómoda, todavía tiene muchas limitaciones que afectan a la reproducibilidad y la precisión para evaluar la migración celular. En primer lugar, el uso manual de puntas de pipeta para crear arañazos está muy influenciado por el ángulo de operación, la fuerza y la velocidad del operador, lo que afecta la repetibilidad del método8. En segundo lugar, los defectos celulares generados por la punta suelen tener bordes dentados en lugar de bordes rectos porque las puntas de pipeta son productos de plástico con cierta elasticidad9. Algunos estudios generan heridas colocando insertos de cultivo prefabricados directamente en la placa de cultivo celular para restringir el rango de proliferación celular10. Este enfoque elude las limitaciones del método basado en puntas, como los bordes irregulares y la reproducibilidad. Sin embargo, incluso con materiales biocompatibles, la coexistencia a largo plazo de la incrustación con las células sigue afectando el crecimiento celular11. Además, la inclusión también puede causar cambios epigenéticos celulares en la zona marginal debido a la restricción de contacto12. Además, los insertos de contacto producidos a partir de materiales biocompatibles son caros y difíciles de reutilizar, lo que limita su viabilidad13. Por lo tanto, se necesita una herramienta novedosa, reproducible y práctica para cuantificar fácilmente la migración celular in vitro .

El objetivo principal de este método es introducir una herramienta innovadora para cuantificar la migración celular in vitro en estudios oncológicos, abordando las limitaciones de las técnicas existentes y mejorando la reproducibilidad y la precisión en la evaluación de la migración celular.

La razón detrás del desarrollo de esta técnica radica en la importancia crítica de evaluar la migración de células tumorales en oncología. Los tumores exhiben características distintivas, que incluyen ventajas de crecimiento selectivo, recableado metabólico y modulación inmunitaria, todo lo cual contribuye a mejorar la migración celular, un aspecto fundamental de la malignidad del cáncer. Este método tiene como objetivo proporcionar un medio más confiable para estudiar la migración celular, contribuyendo a una comprensión más profunda del comportamiento tumoral.

Este método ofrece ventajas sustanciales sobre las técnicas existentes. Los ensayos de rascado manual pueden sufrir interferencias dependientes del operador, mientras que los insertos de cultivo pueden afectar el crecimiento celular y la expresión génica. Por el contrario, este método ofrece una repetibilidad, precisión y practicidad mejoradas, lo que representa una solución rentable para medir la migración celular in vitro en la investigación oncológica. Aborda la necesidad crucial de contar con una herramienta fiable y accesible para estudiar la migración celular en varios tipos de cáncer, lo que la convierte en una valiosa adición al campo.

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Protocolo

Todos los participantes dieron su consentimiento informado completo y por escrito. La aprobación ética no fue aplicable ya que no se incluyeron muestras de tejido animal o humano en el presente estudio.

1. Investigar los requisitos de la comunidad de usuarios

  1. Entregar cuestionarios a los biólogos/experimentadores que trabajan en ensayos de cicatrización de heridas celulares. Recoja los cuestionarios completados y utilícelos para el estudio. Para este estudio, del 12 de octubre de 2021 al 3 de febrero de 2022, se entregaron 100 cuestionarios a 100 biólogos. El porcentaje de respuesta fue del 97%.
  2. Pida a los encuestados que respondan a preguntas como: ¿cuál de los experimentos de rascado de células le molestó más? ¿Y qué herramienta se utilizó para realizar el rascado de la celda? Siga estas preguntas con subpreguntas para rastrear las causas.
  3. Investigar las percepciones de los experimentalistas sobre herramientas como las puntas de pipeta y los insertos de cultivo celular en experimentos de cicatrización de heridas celulares. Comprender y recoger sus razones para seleccionar una herramienta en lugar de otra, utilizando la teoría de la cadena medios-fin basada en técnicas de escalonamiento en la sección14,15 de los cuestionarios.
    NOTA: El método de escalera se divide en dos tipos: el método de escalera blanda con entrevistas en profundidad y el método de escalera dura con cuestionarios o cuestionarios de papel y lápiz16. El método de escalonamiento duro fue la técnica principal utilizada en este estudio. La teoría de la cadena medios-fin sugiere que el conocimiento explícito que poseen los usuarios objetivo es superficial y concreto, mientras que el conocimiento tácito es profundo y abstracto 17,18,19.

2. Diseño y modelado tridimensional

  1. Dibuje un boceto a partir de las ideas recopiladas en la encuesta del cuestionario anterior e inicie el proceso de diseño. Utilice este boceto preliminar como plano fundamental.
    1. Explique las dimensiones y el diseño de cada componente aplicando las funciones Dim, DimRadius y DimDiameter en el software de modelado.
    2. Realice mediciones con el calibrador vernier con una precisión de 0,02 mm en placas reales de 6 pocillos para determinar las dimensiones finales del raspador de celdas. Confirme que tienen 42,1 mm de largo, 42,1 mm de ancho y 18,5 mm de alto. Preste atención a los detalles en la fase de diseño, especialmente la altura del producto y la aptitud en el pozo, para facilitar un montaje más suave.
  2. Construya un modelo tridimensional y renderícelo.
    1. Comience el diseño 3D en un software mediante la creación de un modelo básico. Haga clic en botones como ExtrudeCrv para estirar y Loft para dar forma al diseño. Defina el modelo y, a continuación, haga clic en FilletEdge para suavizar los bordes.
      NOTA: Otros botones de función utilizados incluyen, Líneas - Para dibujar segmentos de línea recta, Polilíneas - Para crear líneas continuas compuestas por múltiples segmentos, Rectángulos - Para dibujar formas rectangulares, Círculos - Para dibujar formas circulares, Arcos - Para dibujar formas de arco o elípticas, Puntos - Para colocar marcadores de un solo punto, Texto - Para agregar etiquetas de texto, Dimensiones - Para agregar dimensiones medidas a modelos, Array - Para crear patrones copiados de objetos, Rotar - Para rotar objetos a los ángulos deseados, Mover - Para mover objetos a nuevas ubicaciones, Escala - Para cambiar el tamaño de objetos más grandes o más pequeños, Recortar/Extender - Para recortar o extender objetos para que se encuentren con otra geometría, Unión/Diferencia/Intersección booleana - Para combinar, restar o encontrar la intersección de objetos, Capas - Para organizar objetos en diferentes capas, Renderizar: para generar vistas renderizadas con materiales e iluminación, y Exportar: para exportar la geometría del modelo a otros formatos de archivo.
    2. Importe el modelo en un software de renderizado 3D. Aplica materiales como plástico, esponja y acero, y luego ajusta la iluminación para obtener una representación realista.
      NOTA: Una lista generalizada de botones de función incluye: Arrastrar y soltar : para aplicar materiales directamente a piezas o modelos arrastrando un material de la biblioteca y soltándolo en el componente deseado en la vista en tiempo real, Clic derecho : al hacer clic con el botón derecho en un material de la biblioteca, normalmente verá opciones para: Aplicar a la selección : aplicar el material a una pieza seleccionada en la vista en tiempo real. Editar material : ajuste las propiedades del material. Propiedades del material (después de seleccionar un material): para acceder y modificar propiedades específicas del material, como el color, la rugosidad, el índice de refracción y otros atributos. Barra de búsqueda: para encontrar rápidamente un material en la biblioteca escribiendo su nombre o palabras clave asociadas. Categorías/Carpetas : para navegar a través de diferentes categorías o carpetas de materiales como metales, plásticos, vidrio, etc. Agregar a favoritos : para marcar ciertos materiales como favoritos para facilitar el acceso durante sesiones futuras. Teclas de acceso rápido : se puede acceder a algunas operaciones a través de teclas de acceso rápido. Por ejemplo, M suele ser la tecla de acceso rápido para mostrar rápidamente las propiedades del material de una pieza seleccionada.
    3. Por último, mejore el contraste (+56) y la saturación de la imagen (Intensidad +19, Saturación +7) en el software de fotografía y diseño, y añada elementos de fondo (información de texto y color de blanco a gris claro) para el contexto y garantizar una representación del producto realista y de alta calidad.
      1. Utilice Ajustes de > de imagen, Brillo/Contraste para ajustar el contraste de una imagen. Utilice Imagen > Tono/Saturación para modificar el nivel de saturación de la imagen. Utilice la herramienta Texto (icono T) para agregar información de texto a la imagen.
        NOTA: Una lista generalizada de botones de función incluye la herramienta Elipse (U) - Para dibujar puntos/círculos. Configure la herramienta para dibujar una forma, elija el color de relleno que desee y, a continuación, haga clic y arrastre (manteniendo pulsada la tecla Mayús para mantener un círculo perfecto) para crear un punto. Herramienta Línea (U) - Para dibujar líneas rectas en la imagen. Seleccione la herramienta, establezca el ancho de línea deseado y, a continuación, haga clic y arrastre para dibujar una línea. Herramienta Pincel (B) - Una forma alternativa de dibujar puntos y líneas. Selecciona el tamaño y la forma del pincel y, a continuación, haz clic (para puntos) o haz clic y arrastra (para líneas).
  3. Después de completar el modelo tridimensional, proceda a producir el raspador de celdas mediante el método de molienda y ensamblaje 20,21,22.

3. Producción

  1. Emplear la teoría de color, materiales y acabado (CMF) en el presente estudio para diseñar los prototipos del raspador de celdas. La teoría CMF sirve como metodología de diseño en la investigación científica. Mejora la usabilidad del producto, moldea la percepción del usuario y dirige la selección de materiales 23,24,25.
    1. Seleccione los colores que se utilizarán en el raspador de celdas del sistema de color estándar, incluidos Negro 6 C, Gris frío 6 C y 11-0601TPG26,27.
    2. Para construir el raspador de celdas que cumpla con los estándares de laboratorio, elija los materiales adecuados, incluidos el polipropileno (PP), la esponja y el acero con alto contenido de carbono. Para la fabricación de prototipos físicos, comience empleando una impresora 3D para producir el marco estructural. Posteriormente, utilice conectores o agentes adhesivos para completar el ensamblaje del raspador.
      NOTA: Para preparar el producto físico del raspador de celdas, muela y ensamble los materiales necesarios. Se deben seguir los protocolos de seguridad a lo largo de todo el proceso para garantizar un producto final seguro y eficaz.
    3. Continúe con el proceso de acabado, que puede implicar corte, esmerilado, pulido, estampado u otras técnicas. Comience lijando el modelo con un papel de lija de grano medio de 120 para eliminar los bordes ásperos.
    4. Siga esto con un papel de lija de grano fino de 220 para lograr una superficie lisa.
    5. Lijado posterior para alisar las superficies, asegurando que los conectores enchufables o incorporados coincidan correctamente.
    6. Únase la corredera I y II de forma segura utilizando los conectores (varillas fijas) para garantizar un montaje robusto y duradero del rascador de celdas. Logre la forma fija final del raspador de celdas a través de una combinación de fijación mecánica y unión adhesiva. Utilice sujetadores, específicamente una estructura de mortaja y espiga, para asegurar las piezas juntas a través de la fuerza mecánica. Además, para mejorar la resistencia del ensamblaje, aplique adhesivo (pegamento) para unir aún más los componentes.
    7. Esteriliza el rascador en autoclave a 121,3 °C durante 30 minutos para garantizar que conserva su forma y propiedades físicas originales.

4. Cultivo celular

  1. Cultive células HOS en un medio esencial mínimo suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina. Cultivarlos a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Cambie el medio de cultivo cada 2 días.
  3. Cuando el crecimiento celular supere el 80% de confluencia, añadir 1 mL de tripsina con 0,25% de EDTA y digerir durante 60 s. A continuación, centrifugar las células a 300 x g durante 5 min para el subcultivo. Retire el sobrenadante y agregue el medio de cultivo para obtener una concentración final de 5 x 104 células por pocillo. Utilice un contador de celdas automatizado para contar celdas.

5. Evaluación del potencial de herida celular del raspador celular y método basado en puntas

  1. Prepare todos los materiales para herir y esterilícelos con radiación ultravioleta exponiéndolos durante 30 min.
  2. Después de la esterilización, enrolle el 100% de las células HOS confluentes en placas de 6 pocillos a una concentración de 5 x 104 células por pocillo utilizando el método de raspado de células o el método basado en puntas.
    1. Para el método basado en puntas, use una punta de 100 μL y arrástrela a través de la celda que contiene el medio con 1 trazo en la dirección horizontal y el otro en la dirección vertical.
    2. Para el método de raspador de celdas, coloque el prototipo de raspador en uno de los pocillos y con la ayuda de la pinza presione suavemente una vez. Las células están heridas. Lleva a cabo cada experimento de herida por triplicado.
  3. Analice todas las heridas celulares utilizando un sistema de microscopio digital y un software de imágenes.

6. Medición de la viabilidad celular y la proliferación celular

  1. Realice todos los ensayos de viabilidad celular siguiendo el protocolo proporcionado en el kit CCK-8.
  2. Incubar las células con solución de CCK-8 durante 2 h a 37 °C, luego medir su absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas para cuantificar la viabilidad de las células.
  3. Diseñe el ensayo de incorporación de 5-etinil-20-desoxiuridina (EdU) para cuantificar con precisión la duplicación del ADN y cuantificar directamente la relación de proliferación celular. Determinar la influencia de diferentes métodos para generar heridas celulares sobre la proliferación celular mediante el ensayo EdU, siguiendo el protocolo descrito en la publicación anterior28.
  4. Tiña las células y toma imágenes de ellas con un sistema de microscopio digital. Asegúrese de que cada experimento se lleve a cabo por triplicado.

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Resultados

Disección de las demandas de los usuarios de herramientas para generar heridas celulares
El método experimental actual para generar heridas celulares exige una mayor mejora para abordar muchos problemas que comprometen la reproducibilidad biológica, la robustez, el consumo económico y la experiencia del usuario del ensayo de curación de heridas celulares. Utilizamos el método de escalonamiento duro para analizar los requisitos de los usuarios involucrados en exp...

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Discusión

El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar una herramienta mecanizada automática para el ensayo de cicatrización de heridas celulares. Hasta donde sabemos, representa el primer intento de aplicar una estructura mecanizada para crear heridas celulares de forma automática con un solo clic. Con esto, nuestro objetivo es abordar las deficiencias del método tradicional basado en puntas, como la baja reproducibilidad y el estado de rayado inestable. Beneficiándose de los resultado...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Sociales (22FYSB023), la Fundación de Investigación del Centro de Diseño Industrial de Hubei (08hqt201412046) y la Fundación de Humanidades y Ciencias Sociales del Departamento de Educación Provincial de Hubei (15Y054).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
CCK-8 KitBeyotime Company, ChinaC0037
digital microscope systemOlympusIX81
fetal bovine serumGibco, USA16000044
HOS Procell Life Science & Technology Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticsversion 6.0
KeyShotLuxionversion 11.03D rendering software
microplate readerBioTek, GermanELX808
Minimum Essential MediumGibco, USA11095080
Pantone matching systemPantonecommercial color matching
penicillin-streptomycinBeyotime Company, ChinaST488
PhotoshopAdobephoto and design software
Rhinoceros 3DRobert McNeel & Associatesversion 7.03D design software
TC20 Automated Cell CounterBio-RadTC20
TrypsinCytiva HyClone, United StateSH30042.01

Referencias

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