En Planta Expresión génica y edición génica en hojas de bambú Moso

Resumen

En este estudio, se desarrolló en bambú un novedoso método de expresión génica y edición génica en planta mediado por Agrobacterium . Este método mejoró en gran medida la eficiencia de la validación de la función génica en el bambú, lo que tiene implicaciones significativas para acelerar el proceso de mejoramiento del bambú.

Resumen

Se desarrolló un novedoso método de transformación génica in planta para el bambú, que evita la necesidad de procesos de inducción y regeneración de callos que requieren mucho tiempo y mano de obra. Este método implica la expresión génica mediada por Agrobacterium a través de heridas y vacío para plántulas de bambú. Demostró con éxito la expresión de genes exógenos, como el reportero RUBY y el gen Cas9 , en hojas de bambú. La mayor eficiencia de transformación para la acumulación de betalaína en plántulas RUBY se logró utilizando la cepa GV3101, con un porcentaje de 85.2% después de la infección. Aunque el ADN extraño no se integró en el genoma del bambú, el método fue eficiente para expresar los genes exógenos. Además, también se ha desarrollado un sistema de edición génica con un reportero nativo utilizando este método, a partir del cual se ha desarrollado un mutante in situ generado por el gen editado de la violaxantina de-epoxidasa de bambú (PeVDE) en hojas de bambú, con una tasa de mutación del 17,33%. La mutación de PeVDE dio lugar a una disminución de los valores de enfriamiento no fotoquímico (NPQ) bajo alta luz, que puede detectarse con precisión con un fluorómetro. Esto convierte al PeVDE editado en un potencial reportero nativo para genes exógenos y endógenos en el bambú. Con el reportero de PeVDE, se editó con éxito un gen de cinamoil-CoA reductasa con una tasa de mutación del 8,3%. Esta operación evita el proceso de cultivo de tejidos o inducción de callos, que es rápido y eficiente para la expresión de genes exógenos y la edición de genes endógenos en el bambú. Este método puede mejorar la eficiencia de la verificación de la función génica y ayudará a revelar los mecanismos moleculares de las vías metabólicas clave en el bambú.

Introducción

La investigación de la función de los genes en el bambú es muy prometedora para la comprensión avanzada del bambú y para desbloquear su potencial de modificación genética. Una forma efectiva de esto se puede lograr a través del proceso de infección mediada por Agrobacterium en hojas de bambú, mediante el cual el fragmento de ADN-T que contiene genes exógenos se introduce en las células, lo que posteriormente conduce a la expresión de los genes dentro de las células de la hoja.

El bambú es un recurso valioso y renovable con una amplia gama de aplicaciones en la fabricación, el arte y la investigación. El bambú posee excelentes propi....

Protocolo

1. Preparación de plántulas de bambú.

1. Prepare plántulas de bambú moso (Phyllostachys edulis) utilizando semillas cosechadas en Guilin, Guangxi, China. Comience remojando las semillas en agua durante 2-3 días, asegurándose de cambiar el agua diariamente. A continuación, crea un sustrato mezclando tierra y vermiculita en una proporción de 3:1.
2. Siembre las semillas empapadas en el sustrato para que germinen. Mantener las plántulas en condiciones de laboratorio, manteniendo la temperatura entre 18-25 °C. Asegurar un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad con una intensidad de luz de 250-350 μmol/m²/s durante l....

Discusión

Este método reduce significativamente el tiempo requerido en comparación con los métodos tradicionales de transformación genética, que suelen tardar entre 1 y 2 años, y logra la expresión transitoria de genes exógenos y la edición genética de genes endógenos en 5 días. Sin embargo, este método tiene limitaciones, ya que solo puede transformar una pequeña proporción de células, y las hojas editadas genéticamente son quiméricas y carecen de la capacidad de regenerarse en plantas completas. Sin embargo, es.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.