Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Resumen

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Resumen

Las fibras musculares esqueléticas obtenidas por disociación enzimática de los músculos de ratón son un modelo útil para experimentos fisiológicos. Sin embargo, la mayoría de los trabajos se ocupan de las fibras cortas del flexor corto de los dedos (FDB), lo que restringe el alcance de los resultados relacionados con los tipos de fibras, limita la cantidad de material biológico disponible e impide una conexión clara entre los fenómenos fisiológicos celulares y los conocimientos bioquímicos y dinámicos previos obtenidos en otros músculos.

Este artículo describe cómo obtener fibras intactas de seis músculos con diferentes perfiles y longitudes de tipo de fibra. Utilizando ratones adultos C57BL/6, mostramos el protocolo de disección muscular y aislamiento de fibras y demostramos la idoneidad de las fibras para estudios transitorios de Ca²⁺ y su caracterización morfométrica. También se presenta la composición de tipo de fibra de los músculos. Cuando se disociaron, todos los músculos quedaron intactos, fibras vivas que se contraen enérgicamente durante más de 24 h. La BDF dio fibras cortas (<1 mm), peroneo corto (PDQA) y peroneo largo (PL) intermedias (1-3 mm), mientras que los músculos extensor largo de los dedos (EDL), extensor largo de los dedos (EHL) y sóleo liberaron fibras largas (3-6 mm).

Cuando se registraron con el colorante rápido Mag-Fluo-4, los transitorios de Ca²⁺ de las fibras PDQA, PL y EHL mostraron una cinética rápida y estrecha que recuerda a la morfología tipo II (MT-II), que se sabe que corresponde a las fibras tipo IIX y IIB. Esto es consistente con el hecho de que estos músculos tienen más del 90% de fibras tipo II en comparación con FDB (~80%) y sóleo (~65%). Más allá de la FDB, demostramos por primera vez la disociación de varios músculos, que dan lugar a fibras que abarcan un rango de longitudes entre 1 y 6 mm. Estas fibras son viables y dan transitorios rápidos de Ca²⁺ , lo que indica que el MT-II se puede generalizar a fibras rápidas IIX y IIB, independientemente de su fuente muscular. Estos resultados aumentan la disponibilidad de modelos para estudios de músculo esquelético maduro.

Introducción

El músculo esquelético maduro de los mamíferos es un tejido multifuncional. Regula fuertemente el metabolismo, es la principal fuente de producción de calor y sus propiedades dinámicas le confieren un papel clave en la respiración, el movimiento de segmentos corporales o el desplazamiento de un punto a otro ^1,2,3. El músculo esquelético también es relevante para la fisiopatología de muchas enfermedades, incluidas las hereditarias y crónicas, como las miopatías, las distrofias o la sarcopenia, así como muchas afecciones crónicas no musculares, como las enfermedades cardiometab....

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética en Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia (UdeA) (actas 104 del 21 de junio de 2016 y 005 del 15 de abril de 2021), de acuerdo con la Ley 84 de 1989 y la Resolución 8430 de 1993 expedida por el Gobierno de Colombia y fueron realizados y reportados en cumplimiento de la Zootecnia: Directrices para la presentación de informes sobre experimentos in vivo (ARRIVE)⁴¹. Todos los resultados presentados aquí provienen de ratones machos sanos, de 7 a 13 semanas de edad, de 20 a 26 g, C57BL/6. En la Figura 1 s....

Discusión

Para complementar los modelos disponibles para estudiar la biología del músculo esquelético maduro, aquí demostramos la disociación enzimática exitosa de una variedad de músculos de ratón con fibras cortas, intermedias y largas. Estas fibras permiten la demostración de la generalización de la cinética MT-II de los transitorios de Ca²⁺ en el músculo esquelético. Además, se clasificaron los tipos de fibras en los músculos enteros intactos. Dado que el FDB es el músculo más utilizado para experim.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Absolute ethanol	Sigma Aldrich	32221
Acetone	Merck	179124
Acrylamide	Gibco BRL	15512-015
Ammonium persulfate	Panreac	141138.1610
Anti myosin I antibody	Sigma Aldrich	M4276	Primary antibody
Anti myosin II antibody	Sigma Aldrich	M8421	Primary antibody
Anti myosin IIA antibody	American Type Culture Collection	SC-71	Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	BF-F3-c	Primary antibody
Bis-acrylamide	AMRESCO	0172
Bovine serum albumin	Thermo Scientific	B14
Bradford reagent	Merck	1.10306.0500
Bromophenol blue	Carlo Erba	428658
Calcium carbonate	Merck	102066
Calcium dichloride (CaCl2)	Merck	2389
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
Collagenase type 2	Worthington	CLS-2/LS004176
Consul-Mount	Thermo Scientific	9990440
Coomassie Brilliant blue R 250	Merck	112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dithiothreitol (DTT)	AMRESCO	0281
Edetic acid (EDTA	AMRESCO	0322
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
Glycerol	Panreac	1423291211
Glycine	Panreac	151340.1067
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Hematoxylin	Thermo Scientific	6765015
HEPES	AMRESCO	0511
Hoechst 33258	Sigma Aldrich	861405
Imidazole	AMRESCO	M136
Isopentane	Sigma Aldrich	M32631
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Mag-Fluo-4, AM	Invitrogen	M14206	Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol	Applichem	A11080100
Methanol	Protokimica	MP10043
Mice	Several	Several	For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)	Promega	V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Tocris	1870
Optimal cutting compound (OCT)	Thermo Scientific	6769006
Secondary antibody	Thermo Scientific	A-11001	Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate	Panreac	1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8	AMRESCO	J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane	AMRESCO	M151
Triton X-100	AMRESCO	M143
Materials
Dissection chamber	Custom-made
Charged slides	Erie Scientific	5951PLUS
Experimental bath chamber	Warner Instruments	RC-27NE2	Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps	World Precision Instruments	500338, 500230
Fine scissors	World Precision Instruments	Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes	Several		Fire-polished tips
Glass vials with cap	Several		2-3 mL volumen
Operating scissors	World Precision Instruments	501223-G
Equipment
Centrifuge	Thermo Scientific	SL 8R
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Cryostat	Leica	CM1850
Digital camera	Zeiss	Erc 5s and Axio 305	Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer	Molecular Devices	1550A Digidata
Electrophoresis chamber	Bio Rad	Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence	Zeiss	Axio Observer A1	Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier	Horiba	R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba	Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope	Zeiss	Stemi 508
Stimulator	Grass Instruments	S6
Water bath	Memmert	WNE-22
Xilol	Sigma Aldrich	808691
Software
Free software for electrophoreses analyses	University of Kentucky	GelBandFitter v1.7	http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry	National Institutes of Health	ImageJ v1.54	https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses	Molecular Devices	pCLAMP v10.05	https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing	OriginLab	OriginPro 2019	https://www.originlab.com/