Procesamiento de tejidos y aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana

Resumen

Este protocolo demuestra una técnica fiable y eficaz para aislar fibroblastos primarios del tejido vaginal humano premenopáusico o posmenopáusico. Los protocolos existentes para el aislamiento de fibroblastos vaginales no tienen en cuenta los desafíos del aislamiento celular del tejido senescente. El tejido vaginal se obtuvo de las mujeres después de la cirugía de prolapso de órganos pélvicos.

Resumen

El prolapso de órganos pélvicos es un trastorno que afecta gravemente a la calidad de vida de las mujeres. Ocurre cuando los músculos y ligamentos se debilitan y hacen que los órganos pélvicos caigan más abajo en la pelvis, creando una protuberancia en la vagina. La cirugía para corregir el prolapso de órganos pélvicos ha sido un tratamiento fundamental. Recientemente, ha habido un creciente interés en estudiar la composición tisular de los pacientes con prolapso a nivel celular.

Actualmente hay poco consenso sobre el efecto de la edad del donante o del paciente en las terapias basadas en células. Los protocolos publicados actualmente para el aislamiento de fibroblastos vaginales se concentran en el tejido premenopáusico o se niegan a comentar sobre la edad del tejido del donante. La mayoría de los protocolos existentes utilizan modelos animales. La consistencia del tejido vaginal humano es más densa que los tejidos utilizados en la mayoría de los protocolos. En este estudio, el tejido vaginal humano se obtuvo principalmente de donantes mayores, lo que probablemente contribuyó al fracaso de los protocolos existentes.

El objetivo de este estudio es describir un protocolo estándar para la adquisición fiable de fibroblastos vaginales humanos, independientemente de la edad de la donante y el estado menopáusico. Los resultados se reprodujeron utilizando tejido de nueve donantes distintos que se sometieron a una cirugía de prolapso de órganos pélvicos. Seis pacientes eran posmenopáusicas, y la donante de mayor edad tenía 78 años. La mediana de edad de los donantes de tejidos fue de 59 años.

Aquí, describimos un método confiable para generar una suspensión unicelular enriquecida con fibroblastos utilizando una combinación de disociación enzimática y mecánica y agrupación de suspensión celular de múltiples biopsias vaginales de un solo donante. El aislamiento fiable de los fibroblastos primarios vaginales humanos puede ser útil en el estudio del prolapso de órganos pélvicos, así como en las interacciones entre el microbioma y el huésped.

Introducción

La disparidad de género en la ciencia y la investigación es un problema constante. La investigación sobre los trastornos que afectan principalmente a las personas de género femenino está infrafinanciada¹. El prolapso de órganos pélvicos es un trastorno fuertemente asociado al sexo femenino. Ocurre cuando los músculos y ligamentos se debilitan y hacen que los órganos pélvicos caigan más abajo en la pelvis, creando una protuberancia en la vagina. Se sabe poco sobre las interacciones celulares en el contexto de esta fisiopatología, ni sobre cómo los factores a nivel tisular influyen en el é....

Protocolo

El tejido vaginal se obtuvo de mujeres sometidas a cirugía de prolapso de órganos pélvicos. El tejido vaginal recolectado después de la cirugía se consideró material de desecho y, de lo contrario, se desecharía. El estudio se realizó de acuerdo con las directrices institucionales y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del General Brigham de Massachusetts.

1. Extracción de tejido vaginal de la paciente

1. Diagnostique el prolapso de órganos pélvicos mediante la anamnesis y los hallazgos del examen pélvico: Se obtuvieron mediciones de la cuantificación del prolapso de ór....

Resultados

Se recolectó tejido vaginal de 10 donantes independientes sometidas a cirugía de prolapso de órganos pélvicos. Utilizando el protocolo descrito, se aislaron células de tejido vaginal humano. Las poblaciones celulares tenían una apariencia característica alargada, plana y en forma de huso. Al igual que otros estudios, observamos una capacidad de duplicación celular significativamente más lenta y una menor capacidad clonogénica de los fibroblastos con el aumento de la edad del do.......

Discusión

Muchos estudios previos han reportado cómo aislar fibroblastos primarios de la vagina humana ^3,7. Varios estudios utilizaron tejido vaginal humano de individuos premenopáusicos con prolapso de órganos pélvicos. A pesar de que algunos trabajos reportaron el uso de tejido de individuos premenopáusicos y postmenopáusicos ^7,11, no describieron con suficiente detalle el .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Bio Techne	B23192
Cell strainer (100 μm)	ThermoFisher Scientific	22363549
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Fisher Scientific	14-959-53A
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Feather Disposable Scalpel No. 15	Socorex	FB.15
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	NC1983075
High Clarity Conical Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
HulaMixer Sample Mixer	ThermoFisher Scientific	15920D
Human Fibronectin DuoSet ELISA	R&D Systems	DY1918-05
Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY6220-05
Liberase Research Grade	Sigma Aldrich	05 401 119 001
Penicillin/Streptomycin (5000U/ml)	ThermoFisher Scientific	15070063
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 20 mm)	Millipore Sigma	P5606
Serologic pipettes (10 mL)	ThermoFischer Scientific	170356N
Sterile syringes (5 mL)	Fischer Scientific	14-955-458