Establecimiento de un modelo fisiológico de microtumor vascularizado humano para la investigación del cáncer

Resumen

Este protocolo presenta un modelo de tumor en un chip fisiológicamente relevante para realizar investigaciones básicas y traslacionales de alto rendimiento sobre el cáncer humano, avanzando en la detección de fármacos, el modelado de enfermedades y los enfoques de medicina personalizada con una descripción de los procedimientos de carga, mantenimiento y evaluación.

Resumen

La falta de modelos de cáncer validados que recapitulen el microambiente tumoral de los cánceres sólidos in vitro sigue siendo un obstáculo importante para la investigación preclínica del cáncer y el desarrollo terapéutico. Para superar este problema, hemos desarrollado el microtumor vascularizado (VMT), o chip tumoral, un sistema microfisiológico que modela de forma realista el complejo microambiente tumoral humano. El VMT se forma de novo dentro de una plataforma microfluídica mediante el cocultivo de múltiples tipos de células humanas en condiciones dinámicas de flujo fisiológico. Esta construcción microtumoral de ingeniería tisular incorpora una red vascular perfundida viva que soporta la creciente masa tumoral al igual que lo hacen los vasos recién formados in vivo. Es importante destacar que los fármacos y las células inmunitarias deben atravesar la capa endotelial para llegar al tumor, modelando in vivo las barreras fisiológicas para la administración y eficacia terapéuticas. Dado que la plataforma VMT es ópticamente transparente, se pueden lograr imágenes de alta resolución de procesos dinámicos como la extravasación de células inmunitarias y la metástasis con la visualización directa de células marcadas con fluorescencia dentro del tejido. Además, el VMT conserva la heterogeneidad tumoral in vivo , las firmas de expresión génica y las respuestas a fármacos. Prácticamente cualquier tipo de tumor se puede adaptar a la plataforma, y las células primarias de los tejidos quirúrgicos frescos crecen y responden al tratamiento farmacológico en el VMT, allanando el camino hacia una medicina verdaderamente personalizada. Aquí, se describen los métodos para establecer el VMT y utilizarlo para la investigación oncológica. Este enfoque innovador abre nuevas posibilidades para el estudio de los tumores y las respuestas a los fármacos, proporcionando a los investigadores una poderosa herramienta para avanzar en la investigación del cáncer.

Introducción

El cáncer sigue siendo un importante problema de salud en todo el mundo y es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Solo para el año 2023, el Centro Nacional de Estadísticas de Salud anticipa más de 1.9 millones de nuevos casos de cáncer y más de 600,000 muertes por cáncer en los EE. UU.¹, lo que destaca la necesidad urgente de enfoques de tratamiento efectivos. Sin embargo, en la actualidad, solo el 5,1% de las terapias contra el cáncer que entran en ensayos clínicos finalmente obtienen la aprobación de la FDA. El fracaso de los candidatos prometedores para progresar con éxito a través de los ensayos clínicos puede atribui....

Protocolo

1. Diseño y fabricación

1. Diseño del dispositivo
   1. Para la fabricación de dispositivos microfluídicos, cree un molde SU-8 utilizando una capa de 200 μm de SU-8 recubierta por centrifugación sobre una oblea de Si (RCA-1 limpia y tratada con fluoruro de hidrógeno (HF) al 2%), seguido de un paso de fotolitografía de máscara única como se describió anteriormente ^8,9.
   2. Funda una réplica de polidimetilsiloxano (PDMS) de 4 mm de espesor a partir del molde SU-8 para generar un molde de poliuretano duradero para los pasos de fabricación posteriores. Se pueden utilizar varias iter....

Discusión

Casi todos los tejidos del cuerpo reciben nutrientes y oxígeno a través de la vasculatura, lo que la convierte en un componente crítico para el modelado realista de enfermedades y la detección de fármacos in vitro. Además, varias neoplasias malignas y estados patológicos se definen por la disfunción endotelial vascular y la hiperpermeabilidad³. En particular, en el cáncer, la vasculatura asociada al tumor a menudo está mal perfundida, interrumpida y permeable, lo que actúa como.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003