Criopreservación de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre embrionarias humanas en la etapa óptima

Resumen

Este estudio proporciona un protocolo detallado para la criopreservación eficiente de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre humanas.

Resumen

Las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) derivadas de células madre embrionarias humanas (hESCs) son fuentes celulares superiores para la terapia de reemplazo celular en individuos con enfermedades degenerativas de la retina; Sin embargo, los estudios sobre el almacenamiento estable y seguro de estas células terapéuticas son escasos. La viabilidad celular altamente variable y la recuperación funcional de las células EPR después de la criopreservación son los problemas más comunes. En el protocolo actual, nuestro objetivo fue lograr la mejor tasa de recuperación celular después de la descongelación seleccionando la fase celular óptima para la congelación en función de las condiciones experimentales originales. Las células se congelaron en la fase exponencial determinada mediante el ensayo de marcaje con 5-etinil-2′-desoxiuridina, que mejoró la viabilidad celular y la tasa de recuperación después de la descongelación. Las células estables y funcionales se obtuvieron poco después de la descongelación, independientemente de un largo proceso de diferenciación. Los métodos descritos aquí permiten la conservación y descongelación simples, eficientes y económicas de las células RPE derivadas de hESC. Aunque este protocolo se centra en las células EPR, esta estrategia de congelación puede aplicarse a muchos otros tipos de células diferenciadas.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa pigmentada de células necesarias para mantener el correcto funcionamiento de la retina. La disfunción y la muerte del EPR están estrechamente asociadas con muchas enfermedades degenerativas de la retina, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinosis pigmentaria y la enfermedad de Stargardt ^2,3. La terapia de reemplazo del EPR es uno de los esquemas de tratamiento más prometedores para estas enfermedades 4,5,6,7.

Protocolo

1. Disociación celular

1. Mantener las células RPE como se ha descrito anteriormente^17,22.
   NOTA: Todas las células se cultivan a 37 °C en una atmósfera con un 5% de_CO2 durante toda la duración de los protocolos.
2. Prepare la cantidad requerida de PBS y medio de cultivo en un baño de agua a 37 ° C y coloque el reactivo de disociación celular a temperatura ambiente.
3. Deseche la solución de cultivo y lave las placas dos veces con 1 mL de PBS precalentado por pocillo.
4. Añadir 1 mL del reactivo de disociación celular a las placas de 6 pocillos y digeri....

Discusión

En el presente estudio, se describe un protocolo exitoso de congelación-descongelación para células RPE derivadas de hESC para necesidades clínicas y de investigación. A diferencia de la línea celular de EPR inmortalizada, ARPE-19, las células EPR con el fenotipo epitelial y la función característicos adecuados, como las células EPR derivadas de células madre, son más sensibles a la criopreservación. Menos del 32% de las células permanecieron a las 24 h después de la descongelación si no se conservaban ad.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049