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Resumen

Este protocolo de predicción de modelado de homología de anticuerpos es seguido por el acoplamiento de Pyrx anticuerpo-receptor y la simulación dinámica molecular. Estos tres métodos principales se utilizan para visualizar las áreas de unión precisas anticuerpo-receptor y la estabilidad de unión de la estructura final.

Resumen

Los anticuerpos de fragmento variable de cadena simple (scFv) se construyeron previamente a partir de cadenas ligeras y pesadas variables unidas por un enlazador (Gly4-Ser) 3. El enlazador se creó utilizando software de modelado molecular como una estructura de bucle. Aquí, presentamos un protocolo para el análisisin silico de un anticuerpo scFv completo que interactúa con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En primer lugar, los autores utilizaron un programa de modelado de estructura de proteínas y Python para el modelado de homología, y la estructura scFv del anticuerpo scFv para la homología. Los investigadores descargaron el software Pyrx como plataforma en el estudio de acoplamiento. La simulación de dinámica molecular se ejecutó utilizando software de modelado. Los resultados muestran que cuando la simulación de MD se sometió a la minimización de energía, el modelo de proteína tuvo la energía de enlace más baja (-5,4 kcal/M). Además, la simulación de MD en este estudio mostró que el anticuerpo EGFR-scFv acoplado fue estable durante 20-75 ns cuando el movimiento de la estructura aumentó bruscamente a 7,2 Å. En conclusión, se realizó un análisis in silico, y las simulaciones de acoplamiento molecular y dinámica molecular del anticuerpo scFv demostraron la efectividad del fármaco inmunoterapéutico diseñado scFv como terapia farmacológica específica para el EGFR.

Introducción

Los cambios conformacionales en la proteína (ligando y receptor) siempre ocurren en función de funciones basadas en la estructura. El estudio de los posibles surcos de unión de la proteína y la predicción de la interacción de unión estable es un método avanzado para preparar fármacos para un mejor uso en el cuerpo humano. El modelado de homología seguido de acoplamiento y simulación dinámica molecular es un método sencillo para la predicción precisa de las interacciones estables de unión entre los residuos de los receptores y los anticuerpos construidos que se utilizan como medicina personalizada específica 1,2. La estructura del modelo predicha puede mostrar cambios conformacionales y reordenamientos en los sitios de unión ligando-receptor, particularmente en la interfaz anticuerpo-receptor. Hay muchas razones para estos cambios, como la rotación de las cadenas laterales, la transformación estructural global o modificaciones más complejas. La razón principal para el modelado de homología es distinguir la estructura terciaria de una proteína de su estructura primaria 2,3.

Un receptor de tirosina cinasa llamado receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) desempeña muchas funciones biológicas en las células cancerosas, como la apoptosis 4,5, la diferenciación 6,7, la progresión del ciclo celular 8,9, el desarrollo 9,10 y la transcripción11. El EGFR es una de las dianas terapéuticas más conocidas para el cáncer de mama12. La sobreexpresión de la actividad regular de las quinasas, como el EGFR, suele conducir a la progresión de las células cancerosas, que puede ser reprimida por muchos tipos de inhibidores del cáncer13. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se utilizó como receptor para la variable de fragmento de cadena única construida específicamente para trabajar contra este receptor. Su estructura predicha se utilizó para probar la actividad de unión de anticuerpos.

En este trabajo, se modeló la estructura del anticuerpo scFv utilizando software de modelado con script Python y el método de modelado de homología14,15. Se puede construir un modelo de homología a partir de las secuencias de proteínas y aminoácidos de receptores y ligandos 16,17. Además, se emplearon tecnologías bioinformáticas avanzadas, como el acoplamiento molecular, para predecir cómo se unirán los ligandos de moléculas pequeñas al sitio de unión objetivo correcto. El acoplamiento equilibraría el desarrollo de nuevos medicamentos dirigidos a múltiples enfermedades. Se tiene en cuenta el comportamiento de enlace 5,18.

Además, el acoplamiento molecular es una técnica crítica para facilitar y acelerar el desarrollo de la unión ligando-receptor. El acoplamiento molecular permite a los científicos examinar virtualmente una biblioteca de ligandos contra una proteína objetivo y predecir las conformaciones de unión y afinidades de los ligandos con la proteína receptora objetivo. La simulación dinámica molecular (MNS) demuestra cómo se mueven los residuos en el espacio, simula los movimientos de los anticuerpos hacia sus receptores y, por último, informa sobre los esfuerzos de diseño de anticuerpos. Este estudio es una predicción novedosa de las dimensiones de la caja de cuadrícula que decidió cómo el anticuerpo scFv se une a EGFR y la detección de la energía y el tiempo de esa unión en MDsimulation.

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Protocolo

1. Predicciones de la estructura secundaria de una proteína variable de fragmento de cadena única (scFv)

  1. Construya la estructura 3D de la proteína de fragmento variable de cadena única (scFv) con el banco de datos de proteínas BLAST (PDB), la numeración KABAT y el software de modelado. El scFv consiste en un enlazador (Gly4-Ser) que conecta una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL).
  2. Utilice el software de modelado molecular para construir el enlazador como una estructura de bucle y realice todos estos métodos como se describe en estudios previos 2,19,20.

2. Selección de plantillas y predicción de estructuras 3D scFv y EGFR y modelado de homología

  1. Elija la plantilla 1ivo para estructuras EGFR (en función de su alta resolución). Descargue el archivo 1ivo.pdb del sitio web de pdb, como se muestra en la Figura 1B.
  2. Prepare el archivo de entrada 1ivo.pdb como se describe a continuación.
    1. En el archivo 1ivo.pdb, elimine todos los ligandos externos abriendo el sitio web pdb.org y seleccionando 1ivo. Estructura, y buscando el nombre de los ligandos bajo el título de molécula pequeña en la página de estructura 1ivo del sitio web de pdb.
    2. Encuentra el nombre del ligando NAG. Abra el archivo 1ivo.pdb descargado del sitio web de pdb y busque el residuo de terminación (TER.).
    3. Eliminar los residuos de los ligandos externos en la estructura 1ivo, comenzando por el residuo después de TRE. y antes de que termine el residuo. Guarde el archivo 1ivo.pdb en el sistema.
  3. Prepare el archivo 1ivo.pdb guardado como se describe a continuación.
    1. Descargue el software de acoplamiento Autodock (autodock.scripps.edu) desde el área de selección de ventanas. Haga clic en Abrir el archivo 1ivo.pdb.
    2. Utilice el comando Editar para seleccionar Añadir hidrógeno > Añadir, seleccione Solo polar y, a continuación, pulse Aceptar.
    3. Utilice el comando Editar para agregar cargos de Kollman (Figura complementaria 1). Utilice el comando Editar para eliminar agua. Guarde el archivo 1ivo.pdb en la PC.
  4. Minimice la energía de la estructura 1ivo.pdb como se describe a continuación.
    1. Descargar SPDBV. software de http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html. Abra el archivo 1ivo.pdb.
    2. Seleccionar todo. Seleccione el comando Rendimiento > Minimización de energía > Ok (Figura complementaria 2). Guarde el archivo 1ivo en la PC.
  5. Prepare el modelo completo scFv utilizando el modelado de homología como se describe a continuación.
    1. Descargue el software de modelado17 y el shell del script Python 3.7.9 desde Window- 64. Guarde los archivos de software descargados en la unidad D.
  6. Prepare los archivos de entrada como se describe a continuación.
    1. Cargue el archivo ScFv Pdb en formato fasta desde el sitio web de NCBI y cambie el nombre del archivo a TARGET.ali. como se describe en el Archivo de codificación suplementaria 1. Elija la plantilla mediante la sección Blast en NCBI, pegue el archivo secuenciado, seleccione en formato pdb 7det.pdb como se describe en el archivo de codificación complementaria 2 y, a continuación, envíelo. A continuación, utilice el sitio web pdb.org para obtener el archivo de plantilla.
    2. Prepare el tercer archivo de entrada como align2d.py (Python) como se describe en el Archivo de codificación complementaria 3, que se abre como se muestra en la figura complementaria 3A. Presione la opción Mostrar más, luego vaya a Editar con IDLE > Editar con EDLE (64 bits). Ejecute utilizando el comando run module 5 en el align2d.py para obtener dos archivos de salida: Tar- 7det.ali y Tar- 7det.pap.
  7. Complete los tres pasos anteriores para usar el comando en el último archivo de entrada.
  8. Agregue un nuevo archivo de entrada model-single.py (archivo de comandos python) como se muestra en el Archivo de codificación suplementario 4 y como se describe a continuación.
    1. Presione la opción Mostrar más, luego vaya a Editar con IDLE > Editar con EDLE3.7 (64 bits). Ejecute utilizando el comando (run module 5) como se muestra en la Figura complementaria 3B.
      NOTA: Los archivos de salida resultantes son los seis archivos de los modelos de homología que se muestran en la Figura complementaria 3C.

3. Predicción y evaluación de la estructura secundaria del receptor

  1. Detecte la corrección y la precisión de los modelos de homología como se describe a continuación.
    1. Cree el diagrama de Ramachandran para los modelos scFv y EGFR descargando la herramienta de visualización de https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
    2. Abra el archivo, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione la secuencia de visualización (Figura complementaria 4). Copie la secuencia y péguela en la base de datos pictórica de estructuras 3D (pdbsum) www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/.
    3. Seleccione buscar por secuencia, pegue la copia de la secuencia y, a continuación, envíela. Cree el gráfico como se muestra en la Figura 1B,D.

4. Acoplamiento proteína-proteína

  1. Descargue el software de la herramienta de detección virtual.
  2. Vaya a Archivo> lea moléculas > cargue 1ivo.pdb. Haga clic con el botón derecho en la proteína en el panel de acoplamiento automático para hacer una macromolécula. Haga clic con el botón derecho del ratón de nuevo para crear un ligando (Figura complementaria 5).
  3. Haga clic en el panel de acoplamiento automático para seleccionar la proteína y, a continuación, seleccione el ligando.
  4. Abre la lista de proteínas. A continuación, en la lista, seleccione scFv Protein.
  5. Ve a Alternar esferas de selección. Ajuste la caja de rejilla al centro del receptor. Haga clic en Adelante cuando aparezca el botón rosa redondo.
  6. Para preparar los archivos pdbqt para las estructuras de anticuerpos scFv y EGFR (1ivo), siga estos pasos.
    1. Vaya a > Usuarios de > Archivos de programa de C (86) y, a continuación, elija el archivo pyrx que contiene los archivos de salida de macromoléculas y proteínas que se guardaron como un archivo pdbqt.
    2. A continuación, guarde el archivo pdbqt de anticuerpo de variable de fragmento de cadena única (scFv).
  7. Descargar el software PyMOL en PyMOL | pymol.org. Utilice el software PyMOL para mostrar las configuraciones de EGFR del receptor de anticuerpos scFv.
    1. Vaya al archivo y abra C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein. Prepare las configuraciones de acoplamiento del scFvanticuerpo que interactúa con el receptor en la Figura 2A como se describe a continuación.
      1. Utilice la opción de visualización para mostrar el archivo del receptor (1ivo) como residuos de secuencia con un fondo blanco que se muestra en la Figura complementaria 6.
      2. Muestre el archivo de configuración de acoplamiento con mayor resolución para ver el color del ligando en los colores de residuo verde y rojo. Visualice la superficie rígida del receptor (1ivo) en amarillo.
  8. Prepare las configuraciones de acoplamiento del scFvanticuerpo que interactúa con el receptor en la Figura 2B, como se describe a continuación.
    1. Descargue el software de acoplamiento desde el área de selección de ventanas. Utilice Autodock para mostrar las configuraciones y conformaciones del EGFR del receptor de anticuerpos scFv.
      1. En Autodock, elija la opción Analizar y, a continuación, abra el resultado de Autodock Vina. Vaya a Archivo y abra C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein.
      2. Seleccione el archivo pdb del receptor de proteínas y, a continuación, seleccione el área de la configuración del ligando (estructura del anticuerpo scFv). Conecte la superficie rígida del receptor con la configuración de la estructura acoplada y oculte el resto del receptor. Oculte los residuos lejanos del receptor de los residuos conectados al ligando, como se muestra en la Figura 2B.
    2. A continuación, se consideró que el complejo proteína-proteína estaba listo para realizar la simulación de MD.

5. Simulación dinámica molecular (simulación MD) del complejo de acoplamiento de anticuerpos EGFR-scFv

  1. Descargue el software de simulación MD y utilícelo de la siguiente manera.
    1. Prepare el archivo pdb EGFR (1ivo) utilizando el asistente de reparación como se muestra en la Figura complementaria 7A. Opere la sección de preproceso para refinar el archivo. Envíe el archivo refinado para que se establezca en el constructor del sistema.
    2. Cargue el software de simulación de dinámica molecular desde el directorio de trabajo. Agregue los iones y actualice el archivo refinado para alcanzar 20 Å para enviar el trabajo (Tabla 1), también se muestra en la Figura complementaria 7B.
    3. Cargue el pdb EGFR (1ivo) desde el archivo importado y, a continuación, elija pasos de tiempo de 100 ns para ejecutarlo (Figura complementaria 7C).
  2. Inicie el análisis de la simulación después de completar la MDsimulation como se describe a continuación.
    1. Cree una carpeta de trabajo y guárdela en el archivo cms. Cargue el archivo cms para realizar este paso en la simulación MD.
    2. Cree un directorio de trabajo para las carpetas de proyectos e informe de los valores de energía. Utilice S.I.D. pdf para informar de la simulación, como se muestra en la Figura 3A, y del diagrama de interacción y el enlace H, como se muestra en la Figura 3B.
    3. Cargue el archivo pdf de cms navegando desde la carpeta y utilice TIP3P como modelo para la minimización del volumen del archivo.
    4. Cree el archivo de solvatación para realizar este paso que se muestra en la figura complementaria 7D. Guarde el archivo pdf a través del software y analice los datos, lo que da como resultado la Figura 4, la Figura 5 y la Figura 6.
  3. Genere una configuración de finalización de MDsimulation mediante la creación del archivo de resolución. Encuentre los resultados en el cuadro de límite, como se muestra en la figura 7.

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Resultados

Utilizando la tecnología de visualización de fagos, se creó el gen scFv anti-EGFR a partir de la línea de hibridomas de células B de ratón C3A820,21. Los modelos de estructura de fragmento de cadena simple variable (scFv) de las estructuras VH y VL se construyeron por separado, según Chua et al.22. Después de eso, los modelos fueron visibles como cintas producidas con RasMol. A continuación, utili...

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Discusión

El EGFR es el principal receptor diana del cáncer de mama. La sobreexpresión de EGFR aumenta los casos de cáncer de mama en todo el mundo. Mientras tanto, los anticuerpos específicos, como las variables de fragmento de cadena única, son anticuerpos que se mueven fácilmente a través de la circulación sanguínea y tienen una tasa de eliminación rápida en el cuerpo. Los anticuerpos son una solución sabia y un fármaco de inmunoterapia eficaz37. Por lo tant...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Ninguno.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Autodock softwareCenter for Computational structural Biology AutoDock (scripps.edu)
Desmond Maestro 19.4 software Schrodingerwww.schrodinger.com 
Download Discovery Studio 2021  Dassault Systems https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
Modeler Version 9.24[17] University of Californiahttps://salilab.org/modeller/9.24/release.html
Pictorial database of 3D structures (pdbsum)EMBL-EBI www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
PyMOL software SchrodingerPyMOL | pymol.org
Pyrx software Sourceforge Download PyRx - Virtual Screening Tool (sourceforge.net)
Python script 3.7.9 shell from the window (64)PythonPython Release Python 3.7.9 | Python.org
SPDBV software Expasyhttp://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html

Referencias

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