Visualización in vivo de la actividad espontánea en la corteza sensorial del ratón neonatal con una resolución de una sola neurona

Resumen

Las áreas sensoriales primarias en el neocórtex exhiben actividades espontáneas únicas durante el desarrollo. Este artículo describe cómo visualizar las actividades neuronales individuales y las áreas sensoriales primarias para analizar las actividades sincrónicas específicas del área en ratones neonatos in vivo.

Resumen

El cerebro de los mamíferos experimenta cambios dinámicos en el desarrollo tanto a nivel celular como de circuitos a lo largo de los períodos prenatales y postnatales. Tras el descubrimiento de numerosos genes que contribuyen a estos cambios en el desarrollo, ahora se sabe que la actividad neuronal también modula sustancialmente estos procesos. En la corteza cerebral en desarrollo, las neuronas exhiben patrones de actividad sincronizados que se especializan en cada área sensorial primaria. Estos patrones difieren marcadamente de los observados en la corteza madura, enfatizando su papel en la regulación de los procesos de desarrollo específicos del área. Las deficiencias en la actividad neuronal durante el desarrollo pueden conducir a diversas enfermedades cerebrales. Estos hallazgos ponen de manifiesto la necesidad de examinar los mecanismos reguladores que subyacen a los patrones de actividad en el desarrollo neuronal. Este artículo resume una serie de protocolos para visualizar las áreas sensoriales primarias y la actividad neuronal en ratones neonatos, para obtener imágenes de la actividad de las neuronas individuales dentro de los subcampos corticales utilizando microscopía de dos fotones in vivo, y para analizar las correlaciones de actividad relacionadas con los subcampos. Mostramos resultados representativos de la actividad sincrónica tipo patchwork dentro de barriles individuales en la corteza somatosensorial. También discutimos varias aplicaciones potenciales y algunas limitaciones de este protocolo.

Introducción

La corteza cerebral contiene varias áreas sensoriales con distintas funciones. Las áreas reciben entradas que se originan en sus órganos sensoriales correspondientes, en su mayoría transmitidas a través de la médula espinal o el tronco encefálico y transmitidas a través del tálamo ^1,2. En particular, las neuronas en cada área sensorial primaria exhiben una actividad sincronizada única durante las primeras etapas del desarrollo, que también se originan en los órganos sensoriales o en los centros nerviosos inferiores, pero esencialmente difieren de las actividades observadas en ....

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para la experimentación animal de la Universidad de Kumamoto y el Instituto Nacional de Genética y fueron aprobados por los comités de experimentación animal.

1. Electroporación intrauterina (IUE)

1. Aparear ratones machos TCA-RFP de origen ICR con ratones ICR hembras de tipo salvaje. Observe el tapón vaginal para verificar si se aparea temprano en la mañana del día siguiente. Observe el abdomen para verificar si está embarazada 2 semanas después.
2. Prepare una solución de plásmido que contenga ....

Discusión

Dado que las actividades espontáneas emergen del órgano sensorial o del sistema nervioso inferior y viajan al área sensorial primaria a través de una vía equivalente a la de^{un sistema nervioso} maduro, es crucial definir el área sensorial primaria y la ubicación de las neuronas fotografiadas dentro del área. En este protocolo, abordamos este requisito mediante el empleo de ratones transgénicos que visualizan los axones talamocorticales y el sistema Superno.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR